五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙保護(hù)作用的研究*

張長城，賈亮亮，許 佳，孫志偉，曾 曉，何毓敏，袁 丁，王洪武

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙保護(hù)作用的研究*

張長城，賈亮亮，許 佳，孫志偉，曾 曉，何毓敏，袁 丁，王洪武△

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

目的:研究五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺(CY)所致小鼠生精障礙的保護(hù)作用。方法:腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠生精障礙模型，檢測小鼠的睪丸及附睪重量、精子密度、活率，流式細(xì)胞術(shù)分析睪丸各級生精細(xì)胞細(xì)胞周期，光、電鏡觀察睪丸組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:五子衍宗湯能夠顯著增加模型小鼠的睪丸及附睪重量，增加精子密度，提高精子活率，恢復(fù)各級生精細(xì)胞百分比;改善環(huán)磷酰胺所致模型小鼠睪丸組織的病理性變化。結(jié)論:五子衍宗湯可以顯著改善環(huán)磷酰胺所致的小鼠生殖功能損害。

五子衍宗湯;環(huán)磷酰胺;生精障礙

五子衍宗湯由枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、車前子組成，具有補(bǔ)腎益精、填精補(bǔ)髓的功效，主治腎虛遺精、陽痿早泄、久不生育，在臨床上常用于男性不育的治療，但五子衍宗湯是否具有拮抗環(huán)磷酰胺所致生精障礙的藥理作用尚未明確。

1 材料與方法

1.1 藥物

五子衍宗湯由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子組成，全部生藥經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院汪鋆植教授鑒定為正品。按照傳統(tǒng)方法煎藥，濃縮至粉末，提取率為18.8%，臨用前配成相應(yīng)濃度的溶液;注射用環(huán)磷酰胺，規(guī)格為0.2g，批號08121021，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 動(dòng)物

BalB/c種雄性小鼠，SPF級，8～9周齡，22g～25g，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 試劑

Bouins液:苦味酸飽和水溶液 750mL，甲醛250mL，冰醋酸 50mL。精子營養(yǎng)液:BWW(NaCl 0.554 g/L、KCl0.0356 g/L、CaCl20.025g/L、KH2PO40.0162 g/L、MgSO4·7H2O 0.0294 g/L、NaHCO30.210g/L、NaPyr 0.003g/L、Nalac 0.370g/L、Glucose 0.100g/L、質(zhì) 量 分 數(shù) 0.5% 的 酚 紅1.0mL、青霉素10000U、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的 BSA。其余藥品均為分析純。

1.4 儀器

SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀，武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司;DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司;H-7500型透射式電子顯微鏡，德國Leica公司;ULTRACUT R型超薄切片機(jī)，奧地利萊卡公司;JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型制備 32只BalB/c雄性小鼠，隨機(jī)分為4組，依次為空白對照組、模型組、五子衍宗湯低劑量組、五子衍宗湯高劑量組。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，連續(xù)注射7d，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水?？瞻讓φ战M和模型組每天灌服1%羧甲基纖維素鈉0.2ml，五子衍宗湯低劑量組給予五子衍宗湯2g/kg，五子衍宗湯高劑量組給予五子衍宗湯4g/kg，各組小鼠連續(xù)給藥35d。

1.5.2 小鼠生殖器官重量的測定 末次給藥24h后稱重，處死小鼠取睪丸和附睪并稱濕重。

1.5.3 小鼠精子密度及精子活率的測定 將盛有6ml精子營養(yǎng)液［1］的試管置于恒溫水浴箱預(yù)熱至37℃，取單側(cè)附睪去除脂肪，剪碎放入試管中搖勻，37℃保溫10min～15min，使精子充分游離，接著取1滴滴入牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算每毫升精子數(shù)。用微量移液器吸取10μl精子懸液，利用SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀進(jìn)行精子活率測定。

1.5.4 小鼠睪丸各倍體生精細(xì)胞比例的影響測定 取單側(cè)睪丸去除包膜、剪碎，置于3ml pH 7.4的PBS試管中，于漩渦震蕩混合器上混合3min，組織細(xì)胞液用200目尼龍網(wǎng)過濾于試管內(nèi)，1500r/min離心5min，棄上清將沉淀懸浮后加3ml PBS，混勻1min，同樣條件重復(fù)洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液。PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至106～107個(gè)/ml 4℃、70%乙醇固定2 h后，低速短時(shí)離心去除固定液，PBS洗2遍，加 40μg/ml的 RNA 酶 400μl，于 37℃ 水浴 30 min，加入100μl PI染液混勻，4℃避光染色30min即可上機(jī)進(jìn)行檢測，計(jì)算出不同倍體細(xì)胞的百分比。

1.5.5 小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察取單側(cè)睪丸石臘切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞與各級生精細(xì)胞的分布情況。環(huán)氧樹脂包埋，做超微切片，電鏡觀察睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管及各級生精細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)各個(gè)指標(biāo)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，各組均數(shù)之間比較進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響

表1顯示，模型組小鼠睪丸重量和附睪重量顯著低于空白對照組，五子衍宗湯低、高劑量均可增加小鼠的睪丸及附睪重，但無顯著性差異。

表1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響(±s，n=8)

表1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05，#P<0.01

組別 劑量(g/kg) 睪丸重(g) 附睪重(g)空 白 組 0.100±0.005*0.032±0.001*模 型 組 0.076±0.013 0.027±0.003五子衍宗湯低劑量組 2 0.087±0.010 0.028±0.002五子衍宗湯高劑量組4 0.089±0.014 0.029±0.002

2.2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響

表2顯示，模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于空白對照組。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增加生精障礙小鼠的精子密度。五子衍宗湯低、高劑量對生精障礙小鼠的精子活率也有一定的提升作用。

表2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)

表2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05， P<0.01

組別 劑量(g/kg) 精子密度(106/ml) 精子活率(%)空 白 組91.25±13.08 67.00± 7.78模 型 組 28.31±5.64 37.13±11.51五子衍宗湯低劑量組 2 61.68±12.23 45.14±13.13*五子衍宗湯高劑量組 4 62.12±25.94 49.00± 7.62*

2.3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細(xì)胞周期的影響

表3顯示，模型組小鼠1C和4C細(xì)胞百分比顯著下降，2C細(xì)胞百分比相對升高。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增性恢復(fù)生精障礙小鼠各級生精細(xì)胞的百分比。

表3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細(xì)胞周期的影響(±s，n=8)

表3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細(xì)胞周期的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05， P<0.01

組別 1C(%) 2C(%) 4C(%)空 白 組52.45±3.17 15.78±1.53 25.46±1.79模 型 組 29.82±1.72 25.08±1.51 16.62±2.07五子衍宗湯低劑量組 40.46±4.73 17.16±1.90 21.91±1.45*五子衍宗湯高劑量組 46.00±0.66 17.60±2.25 18.35±2.45

2.4 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡可見，模型組小鼠睪丸內(nèi)生精小管多退化、萎縮，管壁生精上皮變薄，生精細(xì)胞層數(shù)減少，排列紊亂，精子細(xì)胞較少，腔內(nèi)精子少見，睪丸生精小管間隙明顯增大。五子衍宗湯組小鼠睪丸內(nèi)大部分生精小管的各級生精上皮細(xì)胞層次較明顯，排列較規(guī)則，管腔內(nèi)可見較多成熟精子生成，基本達(dá)到正常的睪丸組織形態(tài)(結(jié)果見圖1)。

圖1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響(HE×200)

2.5 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡下可見，模型組小鼠睪丸生精細(xì)胞較少，并可見明顯的生精細(xì)胞凋亡;治療組睪丸超微結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，五子衍宗湯組可見生精上皮變厚，見正常形態(tài)的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞且生精上皮的中部有爆發(fā)產(chǎn)出的大量精子(結(jié)果見圖2)。

圖2 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，其機(jī)制主要是通過對DNA的烷化作用而干擾細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能。近代研究表明，環(huán)磷酰胺具有明顯的生殖毒性，對睪丸有明顯的損傷作用，導(dǎo)致無精子癥或少精子癥，造成不育［2］。通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，在兒童期因白血病、實(shí)體腫瘤、自身免疫性疾病接受環(huán)烷化劑環(huán)磷酰胺治療的男性患兒，成年后80.2%～92.6%為無精子癥或少精子癥，可導(dǎo)致不育或者出現(xiàn)子代遺傳性缺陷或畸形［3］。中醫(yī)藥對生精障礙有較好的治療效果，但對環(huán)磷酰胺所致生精障礙的治療仍缺乏深入的研究。五子衍宗湯為臨床治療男性不育的常用方劑，本實(shí)驗(yàn)探討了五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸功能損害及生精障礙的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)磷酰胺致生精障礙小鼠模型中，小鼠睪丸重量、附睪重量、精子密度、精子活率等顯著下降，生精小管退化萎縮，生精上皮層次減少，細(xì)胞排列紊亂，初級精母細(xì)胞(4C細(xì)胞)與精子細(xì)胞和精子(1C細(xì)胞)比例顯著減少。五子衍宗湯能夠拮抗環(huán)磷酰胺的生殖毒性，提高睪丸和附睪重量;顯著增加生精障礙小鼠的精子密度及精子的活率;修復(fù)睪丸生精小管生精上皮損傷，使生精小管結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常;促進(jìn)精原細(xì)胞向初級精母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，恢復(fù)各級生精細(xì)胞的比例。

睪丸是精子的生成場所，附睪則對精子的成熟起重要作用。研究結(jié)果提示，五子衍宗湯通過修復(fù)生精上皮，改善生精小管微環(huán)境，促進(jìn)精子的形成和受損睪丸的修復(fù)，從而拮抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生精障礙，恢復(fù)其生殖功能。本實(shí)驗(yàn)初步探討了五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的保護(hù)作用，為五子衍宗湯在臨床上進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］陳德宇，劉麗敏，謝慶東，等.抗精液抗體對精子線粒體功能的影響［J］.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，21(1):4-6.

［2］代江濤，李旭良，魏光輝.環(huán)磷酰胺對睪丸組織端粒酶活性表達(dá)的影響及意義［J］.中華小兒外科雜志，2007，28(1):31-32.

［3］Gatta G，Capocaccia R，ColemanMP，et al.Childhood cancer survival in Europe and the United States［J］.Cancer，2002，1995(8):1767-1772.

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0570-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30973928)

2009-12-28

張長城(1973-)，男(土家族)，湖北長陽人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥藥理學(xué)和中醫(yī)藥防治男科疾病機(jī)制研究。

△通訊作者:王洪武。Tel:0717-6397198，E-mail:hongwuang@126.com。