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    補(bǔ)腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響

    2010-08-22 05:04:26李淑云羅頌平
    關(guān)鍵詞:腎虛動(dòng)物模型臟器

    李淑云,羅頌平

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

    補(bǔ)腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響

    李淑云,羅頌平△

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

    目的:探討補(bǔ)腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響。方法:采用羥基脲灌胃造腎虛排卵抑制大鼠模型,造模成功后予以羅氏促排卵湯和/或針灸補(bǔ)腎法治療,治療后的第6天與雄鼠合籠,合籠后繼續(xù)治療10d取出雄鼠,1周后觀察大鼠內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的情況。結(jié)果:治療后各治療組大鼠內(nèi)分泌激素及臟器濕重及妊娠率均有不同程度的增加。結(jié)論:補(bǔ)腎法包括補(bǔ)腎復(fù)方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進(jìn)行治療,可以有效增加大鼠的妊娠率,但對大鼠其他臟器濕重、內(nèi)分泌指標(biāo)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    補(bǔ)腎法;腎虛排卵抑制模型大鼠;內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率

    本研究以SD大鼠腎虛排卵抑制模型為研究工具,以羅氏促排卵湯和/或針灸補(bǔ)腎法為施加因素,研究補(bǔ)腎法對腎虛排卵抑制模型的促排卵作用。通過觀察與雄鼠合籠各組大鼠的血清性激素、子宮和卵巢等臟器的濕重、妊娠率,探討補(bǔ)腎法對排卵障礙性模型大鼠的妊娠影響,為臨床治療提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    10~12周齡、體重220g~250g左右的 SPF級(jí)SD大鼠,來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.2 藥物、試劑

    1.2.1 羥基脲 魯衛(wèi)藥準(zhǔn)字(2000)第024014號(hào),片劑0.5/片,山東齊魯興華制藥廠生產(chǎn),批號(hào)20010407。

    1.2.2 羅氏促排卵湯方的水提濃縮液 羅氏促排卵湯方組方:菟絲子20g,制巴戟15g,淫羊藿10g,當(dāng)歸 10g,黨參 20g,炙甘草 6g,熟附子 6g(先煎),熟地15g,枸杞子20g,加工制作后每毫升含生藥量為1.55g/ml。

    1.2.3 試劑 E2、P、HCG放免試劑盒,由北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供。

    1.3 分組

    隨機(jī)將SPF級(jí)成熟雌性SD大鼠分為 A組(腎虛排卵抑制模型組)、B組(造模加中藥組)、C組(造模加針刺組)、D組(造模加針刺加中藥組)、E組(正常對照組)5組。

    1.4 方法

    1.4.1 造模方法 成熟雌性大鼠根據(jù)陰道細(xì)胞圖片確定,并在卵泡早期給予羥基脲灌胃,用生理鹽水配制,300mg/kg/d,灌胃第 19天加大藥量為500mg/kg/d,固定飼料統(tǒng)一喂養(yǎng),自由飲水,隔日晨陰道涂片。

    1.4.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 隔日進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查,持續(xù)僅觀察到核上皮或局化上皮,無周期性變化者;病理改變提示為排卵抑制;觀察大鼠的表現(xiàn):出現(xiàn)拱背,蜷縮少動(dòng)、反應(yīng)較為遲鈍、體毛疏松不光亮、肌肉松弛、進(jìn)食量減少等腎虛表現(xiàn),符合腎虛-排卵抑制的證候與病理特征,則造模成功。

    1.5 藥物和/或針灸干預(yù)

    根據(jù)分組情況分別給予干預(yù)。中藥:大鼠藥物的用量根據(jù)大鼠體重?fù)Q算公式計(jì)算而得。公式:公斤體重劑量(mg/kg)dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3(R代表比重系數(shù),B代表大鼠,A代表人)。針灸取穴:取雙側(cè)子宮穴、雙腎俞穴、中極穴、關(guān)元穴,根據(jù)不同部位的穴位進(jìn)針后接電針儀,選用波形、疏密波;電量 15Hz,大小 0.5,加電 10min,將大鼠放入大鼠固定器中,10min后取針。

    1.6 采血與取材

    藥物和/或針灸干預(yù)的第6天,將各組大鼠與雄鼠合籠,合籠后繼續(xù)治療10d后取出雄鼠,各組大鼠繼續(xù)自然喂養(yǎng)7d處死,眼眶后靜脈取血,保留血清待測激素水平。取血后在無菌條件下處死、解剖,剪取垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮,剔除脂肪,各臟器分別用電子分析天平稱濕重。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數(shù)和胚胎直徑。

    1.7 觀測指標(biāo)

    一般情況如形態(tài)、毛色、活動(dòng)、納食、大便等。解剖后肉眼觀察垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮,電子分析天平稱濕重。測定血清促卵泡成熟激素雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)、β 絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)定量。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數(shù)、胚胎直徑。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,測定結(jié)果以±s表示,采用單因素方差分析,2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P小于0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠一般情況

    表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s,n=12,g)

    表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s,n=12,g)

    注:單因素方差分析,同組造模前后比較:*P<0.05, P<0.01;組間比較:同A組比較:#P<0.05,##P<0.01;同E組比較:△P<0.05,△△P<0.01

    組別 造模前體重 造模后體重 造模前后體重差A(yù)組 220.5±13.66 230.8±36.69△△ 10.3±9.54△△ B組 213.3±12.95 240.0±14.12 30.7±6.13 C組 219.2±10.02 251.9±16.32 32.8±4.32 D 組 213.4± 7.44 232.9±27.25△# 19.4±9.70△ E組 217.0± 8.70 263.1±14.89## 46.1±3.30

    2.2 觀察體重變化情況

    造模成功后進(jìn)行治療并合籠,觀察治療前后體重變化。

    表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s,g)

    表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s,g)

    注:因素方差分析,同組治療前后比較:*P<0.05, P<0.01;治療前和治療后組間比較:同 E組比較:△P<0.05,△△P<0.01

    組別 n 治療前體重 治療后體重 治療前后體重差A(yù)組 4 235.5±19.000△△ 268.2±43.980△△ 32.7±26.862 B 組 4 254.5±15.780 335.5±30.610 81.0±32.270 C組 3 251.3± 8.505 299.3±20.232△ 48.0±10.985 D組 4 230.3±18.892△△ 292.3±26.424△△ 62.0± 8.524 E組 6 272.8±19.763 355.2±18.670 82.3±11.498

    2.3 各組大鼠臟器濕重情況

    2.4 各組大鼠 E2、P、β-HCG

    表3 各組大鼠臟器濕重(±s,g)

    表3 各組大鼠臟器濕重(±s,g)

    注:單因素方差分析,治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05,##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05,△△P<0.01;C與 D比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

    組別 n 子宮 卵巢 腎臟 腎上腺 脾臟 腦垂體A組 4 3.116±4.036 0.147±0.042 1.883±0.330 0.068±0.0098 0.863±0.263 0.0097±0.0022 B組 4 6.840±5.700 0.148±0.042 2.084±0.298 0.077±0.0187 0.839±0.127 0.0100±0.0027 C組 3 8.346±3.870#△ 0.159±0.037 2.083±0.122 0.084±0.0171 1.092±0.227 0.0066±0.0089 D組 4 3.516±3.166▲ 0.113±0.018 1.875±0.085 0.078±0.0093 0.849±0.206 0.0080±0.0008 E組 6 6.398±2.440 0.155±0.028 1.981±0.119 0.065±0.0168 0.803±0.098 0.0077±0.0027

    表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

    表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

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    2.5 各組大鼠妊娠情況

    表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

    表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

    注:因素方差分析,治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05,##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05,△△P<0.01

    組別 n 受孕例數(shù) 胚胎大小(cm) 胚胎數(shù)(個(gè)) 妊娠率(%)A 組 4 2 0.375±0.479 6.25±7.228△50 B組 4 3 0.800±0.606 8.25±5.560 75 C組 3 3 0.900±0.115 10.50±1.528 100 D組 4 3 0.625±0.479 8.25±5.737 75 E組 6 6 0.833±0.151 14.50±2.074#100

    3 討論與結(jié)論

    3.1 羥基脲造模方法的選擇與使用

    羥基脲(Hydroxyurea,簡稱 HU),又稱羥基脲素,分子式為CH4N2O2,為白色或無色針狀結(jié)晶,無臭,味微澀,微溶于水及醇,固體干燥狀態(tài)較穩(wěn)定,遇水不穩(wěn)定,血漿最高血藥濃度(Tmax)為1h~2h,6h從血中消失,可透過血-腦脊液屏障,20%在肝內(nèi)代謝,80%由尿排出。羥基脲是一種核苷酸還原酶抑制劑,在核苷酸代謝過程中發(fā)揮中心作用,是一種別構(gòu)酶,是惟一受到高度調(diào)控的酶系統(tǒng)。它將二磷酸核苷酸轉(zhuǎn)化為于脫氧核糖核苷酸,參與DNA合成過程中所有前體物的凈合成,該酶活力直接影響DNA合成及腫瘤細(xì)胞增殖。

    現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對腎虛的研究認(rèn)為,下丘腦細(xì)胞損害和功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎(chǔ),因其損害引起下丘腦-垂體-腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸不同程度的功能紊亂,同時(shí)代謝器官、免疫系統(tǒng)也出現(xiàn)功能和病理的改變,故而腎虛是有物質(zhì)基礎(chǔ)的,是“腎”的功能衰退而引起機(jī)體一系列病理變化,包括免疫功能低下、內(nèi)分泌功能紊亂和三大物質(zhì)代謝障礙等[1]。因此,用羥基脲造成的腎虛動(dòng)物模型,是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立的具有人類證候表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對象,該模型已被廣泛認(rèn)可并使用[2~5]。對于腎陽虛證動(dòng)物模型造模方法,陳英華等進(jìn)行了綜述研究,認(rèn)為腎陽虛動(dòng)物模型主要有兩大內(nèi)容:一是腎陽虛證病理動(dòng)物模型,主要有腎上腺皮質(zhì)功能受抑制模型、甲狀腺功能受抑制模型、性腺功能受抑制模型、DNA合成抑制腎陽虛模型等;二是腎陽虛證病因動(dòng)物模型,主要有恐傷腎腎虛動(dòng)物模型、老年腎虛動(dòng)物模型、房勞墮胎傷腎腎虛動(dòng)物模型、先天腎虛動(dòng)物模型等[6]。

    本實(shí)驗(yàn)選用羥基脲建立成熟雌性大鼠腎虛排卵抑制模型(給予羥基脲300mg/kg/d,連續(xù)18d,第19天開始再給予羥基脲500mg/kg/d,連續(xù)11d)。卵巢病理切片卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,造模大鼠卵巢組織中次級(jí)生長卵泡與成熟卵泡的比例明顯減少,而以原始卵泡和初級(jí)生長卵泡為主,提示造模成功。

    3.2 羅氏促排卵湯藥物作用和分析

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主生殖,腎為先天之本,元?dú)庵?,主藏精氣,在機(jī)體的整個(gè)生命活動(dòng)中起著主導(dǎo)作用。腎精包括先天之精與后天之精,為生長發(fā)育與生殖之源,故在狹義上又稱為“生殖之精”。腎精是婦女月經(jīng)與胎孕的物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為,腎在月經(jīng)產(chǎn)生的機(jī)理當(dāng)中,具有相當(dāng)于下丘腦-垂體-卵巢軸中下丘腦一級(jí)的調(diào)節(jié)功能,可調(diào)控卵巢的排卵及內(nèi)分泌功能[8、9]。中醫(yī)名家羅元愷教授認(rèn)為,不排卵者多數(shù)為腎陽虛衰,腎陽虛具有垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能低下的表現(xiàn)[7]。羅氏促排卵湯的處方藥物有:菟絲子、制巴戟、淫羊藿、當(dāng)歸、黨參、炙甘草、熟附子、熟地、枸杞子,全方以補(bǔ)腎助陽為主,佐以健脾養(yǎng)血填精,陰陽并重,臨床應(yīng)用于腎陽虛為主的不孕癥患者。

    本實(shí)驗(yàn)SD大鼠羥基脲造模成功后,予以補(bǔ)腎法治療干預(yù),包括羅氏促排卵湯煎劑、針刺加電針、羅氏促排卵湯煎劑+針刺加電針進(jìn)行治療干預(yù),治療后與雄鼠合籠,可以使治療各組的大鼠妊娠率增加,子宮、卵巢濕重也有不同程度的增加,特別是針灸組子宮濕重的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明針灸治療能有效刺激排卵,增加妊娠數(shù)從而增加子宮重量。而腎、腎上腺、脾、腦垂體的變化不明顯,考慮羥基脲腎虛造模對腎、腎上腺、脾、腦垂體的影響不大,故而治療干預(yù)后各組之間也無明顯差異性。模型組大鼠造模成功后,沒有其他干預(yù)措施,本身有自然恢復(fù)傾向,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。

    3.3 針灸治療不孕癥

    針灸療法治療不孕癥,歷史久遠(yuǎn)?,F(xiàn)代研究提示,針灸治療不孕癥組要通過以下幾個(gè)途徑起作用:①針刺調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能,使內(nèi)分泌激素水平改變,生殖內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常;②針灸可使患者處于低水平的尿17-羥和尿-17酮含量增高,認(rèn)為針灸有增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能與調(diào)節(jié)性腺軸的作用;③對于輸卵管炎癥及阻塞性不孕癥,針灸治療可改善微循環(huán)及血流變性質(zhì),從而促進(jìn)炎癥、壞死組織的吸收和消退,加快組織的修復(fù)和再生,有利于輸卵管的通暢。針灸對體內(nèi)的性激素有雙向調(diào)節(jié)作用,可通過興奮下丘腦-垂體系統(tǒng)而使性腺激素分泌增加,在此過程中可能有某些神經(jīng)遞質(zhì)參與,調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)而影響性腺的分泌。針灸療法對卵巢的影響,可以促進(jìn)排卵,效果基于一定的雌激素水平,針后出現(xiàn)皮膚溫度升高,即交感神經(jīng)中樞受抑制效果較后。電針可以影響內(nèi)啡肽物質(zhì)和下丘腦-垂體-卵巢軸的功能而排卵。許爽君等觀察針刺配合補(bǔ)腎調(diào)沖中藥對治療功能性無排卵患者的促排卵作用。結(jié)果提示,治療后排卵率達(dá)74.8%,基礎(chǔ)體溫連續(xù)測定雙相率明顯提高,卵泡及子宮內(nèi)膜生長發(fā)育比較顯示治療后比治療前顯著增加,血清雌二醇和孕酮水平亦比治療前明顯提高,這就表明針刺配合補(bǔ)腎調(diào)沖中藥有較好的促進(jìn)血清雌二醇和孕酮正常分泌的作用,能明顯促進(jìn)卵泡及子宮內(nèi)膜的生長發(fā)育,有強(qiáng)烈的促排卵、健內(nèi)膜作用,可顯著提高排卵和妊娠率[8]。馬瑞芬等對不孕癥患者72例采用針刺療法,觀察其促排卵與血相關(guān)指標(biāo)的變化,結(jié)果顯示針刺可使脈沖頻率低者加速而促使卵泡生長排卵,促排卵是通過中樞起效,針刺治療后血E2水平也有不同程度的上升[9]。

    本實(shí)驗(yàn)所選穴位包括關(guān)元、中極、子宮、腎俞。關(guān)元,中極屬于任脈,均為任脈與足三陰經(jīng)的交會(huì)穴,位于臍下,鄰近胞宮,關(guān)元為元陰元陽關(guān)藏之處,能調(diào)和沖任,通于肝脾腎三經(jīng),燮理元陰元陽,取此二穴位既能健脾導(dǎo)滯,又能疏肝理氣行瘀,還能補(bǔ)益腎陽腎陰,調(diào)和充任氣血。腎俞穴為腎的背俞穴,是腎臟精氣聚集處,取之能補(bǔ)益腎陽,暖功散寒。子宮穴為治療婦科疾病的經(jīng)外奇穴及經(jīng)驗(yàn)穴,取之能調(diào)經(jīng)種子,理氣止痛。本實(shí)驗(yàn)選用關(guān)元、中極、子宮、腎俞的穴位,均位于腹部及背部,比較容易固定,因大鼠好動(dòng)依從性差,可以順利完成針刺和電針操作。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示,針刺治療何以改善內(nèi)分泌水平,提高妊娠率,模型組大鼠造模成功后,沒有其他干預(yù)措施,本身有自然恢復(fù)傾向,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。由于樣本含量不夠大,雖然不同組別大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果有變化,但有一些在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無顯著性。

    4 結(jié)論

    通過對SD大鼠羥基脲造模形成腎虛排卵障礙的動(dòng)物模型進(jìn)行治療的實(shí)驗(yàn)研究,可以得出以下結(jié)論。

    4.1 應(yīng)用羥基脲造??梢猿晒υ斐赡I虛排卵抑制大鼠動(dòng)物模型,并以腎虛癥狀為主,兼見脾虛的癥狀。

    4.2 補(bǔ)腎法包括補(bǔ)腎復(fù)方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進(jìn)行治療,可以有效提高大鼠的妊娠率、妊娠胚胎數(shù)目,不同程度增加子宮及卵巢濕重,但對大鼠其他臟器濕重、內(nèi)分泌指標(biāo)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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    △指導(dǎo)老師

    R285.5

    B

    1006-3250(2010)07-0567-03

    2009-11-08

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