補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織AR表達(dá)的影響*

蔣士卿，王淑玲，閆愛華

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 45000;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450052)

補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織AR表達(dá)的影響*

蔣士卿1，王淑玲2，閆愛華2

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 45000;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450052)

目的:通過觀察補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織中AR表達(dá)的影響，探討補腎化痰中藥防治慢支的作用機理。方法:將健康雄性Wistar大鼠72只隨機均分為正常對照組、慢支模型組、氣管炎咳嗽痰喘丸組、補腎化痰大劑量組、補腎化痰小劑量組和自然恢復(fù)組，每組12只，采用香煙煙霧吸入法建立雄性大鼠慢支模型，在模型復(fù)制成功后分別灌胃給藥補腎化痰中藥和氣管炎咳嗽痰喘丸，治療時間為30d，采用免疫組化SP法檢測各組大鼠氣管和肺組織中雄激素受體(AR)的表達(dá)，采用放免法測定各組大鼠血清睪酮(T)的含量。結(jié)果:與正常對照組比較，慢支模型組和自然恢復(fù)組大鼠氣管和肺內(nèi)支氣管AR的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，血清T水平明顯下降(P<0.01);與慢支模型組比較，補腎化痰大、小劑量組和氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管和肺內(nèi)支氣管中AR表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.001)，血清 T水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論:補腎化痰中藥能使煙熏雄性大鼠慢支模型的氣管和肺組織中AR的高水平表達(dá)降低，血清低水平T含量升高，提示補腎化痰中藥調(diào)節(jié)雄激素及其受體水平可能是其治療慢支的作用機理之一。

雄性大鼠;慢性支氣管炎;補腎化痰中藥;氣管炎咳嗽痰喘丸;雄激素受體(AR)、睪酮(T)、香煙煙霧吸入;免疫組化

本研究采用香煙煙霧吸入法建立雄性大鼠慢支模型，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測大鼠氣管和肺組織中雄激素受體(AR)的相對含量，探討補腎化痰中藥對雄性慢支大鼠氣管和肺組織中AR表達(dá)的影響，為研究補腎化痰中藥防治慢支的作用機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性Wistar大鼠72只，體重180g～220g，由河南省實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組、慢支模型組、氣管炎咳嗽痰喘丸組、補腎化痰大劑量組、補腎化痰小劑量組和自然恢復(fù)組6組。

1.2 藥物與主要試劑

補腎化痰中藥由何首烏、淫羊藿、蛇床子、五味子、菟絲子、覆盆子、款冬花、紫菀組成，水煎濃縮至每毫升相當(dāng)于含生藥1.5g;氣管炎咳嗽痰喘丸為中國北京同仁堂集團公司產(chǎn)品，批號1080032，使用時用蒸餾水配制成每毫升含藥物0.105g的混懸液。“鴻禧”牌84mm烤煙型香煙由河南汝州卷煙廠生產(chǎn)，焦油量17mg，煙氣煙堿量1.1mg?？勾笫驛R第一抗體為抗AR羧基端多肽片段的親和純化兔多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品;SP系列工作液試劑盒及DAB試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;睪酮(T)放免試劑盒(包被管法)為天津德普生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品。

1.3 慢性支氣管炎模型的建立

參照文獻(xiàn)方法并進行改良采用香煙煙霧吸入法建立大鼠慢性支氣管炎模型。自制1個1740mm×1100mm×1500mm的煙熏箱，頂部對角留兩個2mm×3mm的通氣孔，將除正常對照組以外的其余5組大鼠分別裝于自制的鋼絲籠內(nèi)，每籠6只，放置于煙熏箱中的架子上，香煙每份4支，用鐵絲捆扎，點燃后分別懸掛于鋼絲籠下，15min后點燃第二批香煙，共用香煙64支。每次50min，每天2次，38d后改為每天1次，每次50min，用煙量同前，共計76d。

1.4 動物處理及組織切片的制作

慢支模型組于煙熏76d后的當(dāng)天上午氯胺酮麻醉，腹主動脈抽血，離心分離血清，分裝后 －20℃保存待測，小心剖取氣管和肺，剪取右肺的一葉和氣管放入4%的中性甲醛固定液中;補腎化痰中藥組與氣管炎咳嗽痰喘丸組均采用治療給藥，在停止煙熏的當(dāng)天，氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠灌胃氣管炎咳嗽痰喘丸藥物混懸液(每毫升含藥物0.105g，相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的10倍);補腎化痰小劑量組將補腎化痰中藥濃縮液稀釋至每毫升含生藥0.75g灌胃(相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的5倍);補腎化痰大劑量組直接灌胃補腎化痰中藥濃縮液(每毫升含生藥1.5g，相當(dāng)于成人臨床常規(guī)用量的10倍);自然恢復(fù)組給予蒸餾水灌胃;正常對照組不進行煙熏，僅從第76天開始灌胃蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)30d，在灌胃結(jié)束后的第2天處死全部大鼠，處死方法和標(biāo)本收集與慢支模型組相同。

從固定液中取出標(biāo)本，修塊，乙醇梯度脫水，低熔點石蠟包埋，3μm～4μm切片，用鉻礬明膠處理過的載玻片直接上片。

1.5 AR免疫組化染色及結(jié)果判斷

各組大鼠氣管和肺組織的AR免疫組化染色步驟按照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，以大鼠睪丸組織標(biāo)本作為陽性對照，以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。并用高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)測定AR陽性細(xì)胞的平均灰度和平均光度。

1.6 血清睪酮(T)含量測定

采用SN-695型智能放免γ測量儀檢測各組大鼠血清睪酮(T)水平，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氣管中雄激素受體(AR)的表達(dá)

表1顯示，與正常對照組(圖1)比較，慢支模型組大鼠(圖2)和自然恢復(fù)組大鼠氣管中AR的表達(dá)(圖3)均明顯增強(P<0.01);補腎化痰大劑量組氣管中AR的表達(dá)(圖4)略強于正常對照組，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);自然恢復(fù)組大鼠 AR相對含量低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與慢支模型組比較，補腎化痰大劑量組和小劑量組大鼠氣管AR的表達(dá)(圖5)明顯減弱(P<0.01)，氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管中AR的表達(dá)(圖6)減弱最顯著(P<0.001);自然恢復(fù)組大鼠氣管中AR的表達(dá)雖略有減弱，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 雄激素受體(AR)在各組大鼠氣管中的表達(dá)(±s)

表1 雄激素受體(AR)在各組大鼠氣管中的表達(dá)(±s)

注:與慢支模型組比較: P<0.01， P<0.001;與正常對照組比較:△△P<0.01

組別 n 平均灰度 平均光度正 常 對 照 組 12 99.9± 7.75 0.293±0.05 慢 支 模 型 組 12 87.0± 9.60△△ 0.358±0.06△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 106.7±11.29 0.265±0.04 補腎化痰大劑量組 12 102.8±12.17 0.289±0.06 補腎化痰小劑量組 12 103.2±12.28 0.293±0.05 自 然 恢 復(fù) 組 12 90.6± 6.28△△ 0.346±0.03△△

2.2 各組大鼠肺組織中雄激素受體(AR)表達(dá)

表2顯示，與正常對照組(圖7)比較，慢支模型組大鼠(圖8)和自然恢復(fù)組大鼠肺組織中AR的表達(dá)(圖9)均明顯增強(P<0.05)，補腎化痰大劑量組(圖10)和補腎化痰小劑量組大鼠肺組織中 AR的表達(dá)(圖11)略強于正常對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺組織中AR的表達(dá)(圖12)低于正常對照組，但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與慢支模型組比較，補腎化痰大劑量組和小劑量組大鼠肺組織AR的表達(dá)明顯減弱(P<0.05或 P<0.01)，以氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺組織中 AR的表達(dá)減弱最顯著(P<0.01)。用PBS代替一抗的大鼠氣管(圖13)和肺組織(圖14)均無陽性細(xì)胞出現(xiàn)。

圖1 AR在正常對照組大鼠氣管的表達(dá)免疫組化(×200)

圖2 AR在慢支模型組大鼠氣管的表達(dá)免疫組化(×200)

圖3 AR在自然恢復(fù)組大鼠氣管的表達(dá)免疫組化(×200)

圖4 AR在補腎化痰大劑量組大鼠氣管的表達(dá)免疫組化(×200)

圖5 AR在補腎化痰小劑量組大鼠氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖6 AR在氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

表2 雄激素受體(AR)在各組大鼠肺組織中的表達(dá)(±s)

表2 雄激素受體(AR)在各組大鼠肺組織中的表達(dá)(±s)

注:與慢支模型組比較:*P<0.05， P<0.01， P<0.001;與正常對照組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 平均灰度 平均光度正 常 對 照 組 12 140.5± 6.04* 0.114±0.015 慢 支 模 型 組 12 134.4± 5.92△ 0.143±0.023△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 149.9±15.21 0.092±0.034 補腎化痰大劑量組 12 142.2± 9.25* 0.117±0.029*補腎化痰小劑量組 12 143.2± 7.93 0.124±0.016*自 然 恢 復(fù) 組 12 135.1± 5.29△ 0.139±0.017△△

圖7 AR在正常對照組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖8 AR在慢支模型組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)免疫組化(×200)

圖9 AR在自然恢復(fù)組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖10 AR在補腎化痰大劑量組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖11 AR在在補腎化痰小劑量組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖12 AR在在氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺內(nèi)支氣管的表達(dá)，免疫組化(×200)

圖13 用PBS代替一抗，慢支模型組大鼠氣管中未見AR陽性細(xì)胞(陰性對照)，免疫組化(×200)

圖14 用PBS代替一抗，慢支模型組大鼠肺內(nèi)支氣管中未見AR陽性細(xì)胞(陰性對照)免疫組化(×200)

2.3 各組大鼠血清睪酮(T)水平

表3顯示，與正常對照組比較，慢支模型組和自然恢復(fù)組大鼠血清T水平顯著下降(P<0.01);與慢支模型組比較，補腎化痰大、小劑量組和氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠血清T水平均明顯升高(P<0.05)，以補腎化痰大劑量組升高幅度最大，自然恢復(fù)組大鼠血清T水平雖有上升的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清睪酮(T)水平(±s)

表3 各組大鼠血清睪酮(T)水平(±s)

注:與慢支模型組比較:*P<0.05， P<0.01;與正常對照組比較:△△P<0.01

組別n T(nmol/L)正 常 對 照 組 12 4.86±2.29 慢 支 模 型 組 12 2.16±1.12△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 3.30±1.15*補腎化痰大劑量組 12 3.55±1.44*補腎化痰小劑量組 12 3.44±0.96*自 然 恢 復(fù) 組 12 2.37±0.97△△

3 討論

近年來，從下丘腦-垂體-性腺軸探討呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究報道逐漸增多，慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清睪酮(T)水平明顯低于正常人;也有研究發(fā)現(xiàn)，在正常雄性大鼠的氣管和肺組織中存在雄激素受體(AR)的表達(dá)，推測老年人體內(nèi)雄激素水平降低，通過AR直接影響氣管和肺組織，導(dǎo)致氣管和肺功能減退，可能是老年人慢支發(fā)病率顯著高于青年人的主要原因，并且認(rèn)為雄激素及其受體可能是中醫(yī)學(xué)“肺腎相關(guān)”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本研究觀察了補腎化痰中藥對煙熏慢支雄性大鼠氣管和肺組織中AR表達(dá)的影響，對于探討從“腎”論治慢支的機理有重要意義。

研究結(jié)果顯示，煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織中AR的表達(dá)明顯強于正常對照組，血清T水平明顯低于正常對照組。雄激素對AR的調(diào)節(jié)作用有的為升調(diào)節(jié)，有的為降調(diào)節(jié)，因此低水平的雄激素也可能導(dǎo)致AR的高表達(dá)。但我們在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，此時睪丸中的AR mRNA表達(dá)量是降低的，說明血清雄激素水平的降低并不是導(dǎo)致氣管、肺組織中AR高表達(dá)的主要原因。由于香煙煙霧吸入引起氣管中AR高表達(dá)的升高程度高于肺組織，由此可以推測，氣管和肺組織中AR的高表達(dá)可能主要與香煙中有害物質(zhì)的直接刺激有關(guān)。梁澍等報道，肺癌患者癌組織中AR陽性表達(dá)率為61.7%，且AR在肺鱗癌的陽性表達(dá)率明顯高于肺腺癌。韓勇等研究顯示，患慢性支氣管炎、肺氣腫病史的 COPD患者，肺癌發(fā)生的危險性明顯增高(P<0.05)，因此氣管、肺組織中AR的高表達(dá)是否為香煙誘發(fā)肺癌的原因之一，值得進一步研究。

自然恢復(fù)組大鼠氣管和肺組織中AR的表達(dá)量及血清T水平與慢支模型組比較均無顯著性差異，這可能與停止香煙煙霧吸入的時間較短(30d)有關(guān)，提示長期吸煙即使戒煙也不能在短時間內(nèi)完全恢復(fù)正常。

補腎化痰中藥是由五子衍宗丸加化痰藥加減而成，五子衍宗液內(nèi)服可使老年(60歲 ～80歲)腎虛衰老癥狀的總積分值下降，血漿睪酮(T)含量上升，雌二醇(E2)與T比值下降。本研究顯示，由五子衍宗丸化裁而來的補腎化痰中藥能使煙熏大鼠慢支模型已經(jīng)出現(xiàn)的氣管、肺組織中AR的高水平表達(dá)顯著降低，血清T水平明顯升高，推測補腎化痰中藥通過調(diào)節(jié)雄激素及其受體的表達(dá)水平可能是其治療慢支的作用機制之一，同時也提示戒煙后加用補腎化痰中藥能促進其修復(fù)，但補腎化痰中藥影響氣管及肺組織AR表達(dá)量的具體途徑仍不清楚。

總之，煙熏大鼠慢支模型伴有氣管、肺組織中AR的異常表達(dá)，補腎化痰中藥對AR的異常變化有一定治療作用。但AR的異常變化在呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病中的作用如何?香煙煙霧通過哪些途徑影響AR的表達(dá)?補腎化痰中藥通過哪些環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)AR的表達(dá)等等，均有待進一步研究。

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0772-03

河南省杰出青年科學(xué)基金資助項目(04120001000)

2010-01-26