環(huán)境因素對痹證大鼠自身抗體表達的影響

申洪波，白云靜，胡蔭奇

(1.北京大學第三醫(yī)院，北京 100191;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學院 望京醫(yī)院，北京 100102)

環(huán)境因素對痹證大鼠自身抗體表達的影響

申洪波1，白云靜2，胡蔭奇3

(1.北京大學第三醫(yī)院，北京 100191;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學院 望京醫(yī)院，北京 100102)

目的:研究環(huán)境因素對痹證大鼠類風濕關節(jié)炎(RA)相關自身抗體表達及關節(jié)破壞程度的影響。方法:32只大鼠隨機分為對照組、模型組、寒濕組和濕熱組，除對照組外其余3組造模后給予相應環(huán)境刺激。結果:第2、4周時，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清RF、anti-CCP滴度及 AKA、APF陽性率均明顯高于對照組，4周時 AKA、APF陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05);濕熱組、寒濕組大鼠骨破壞嚴重。結論:環(huán)境因素影響了大鼠RA相關自身抗體表達和關節(jié)破壞程度。

類風濕關節(jié)炎;自身抗體;環(huán)境因素;實驗研究

類風濕關節(jié)炎屬中醫(yī)痹證范疇，中醫(yī)學認為痹證的形成與環(huán)境因素密切相關。為研究環(huán)境因素與類風濕關節(jié)炎相關自身抗體表達的關系，筆者用完全福氏佐劑及人工合成CCP多肽免疫動物，并給予寒濕和濕熱環(huán)境刺激，觀察了環(huán)境因素對RA相關自身抗體表達的影響以及對RA關節(jié)破壞的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選取適齡健康雌性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SCXK(京)2002-0003)32只，依照隨機數字表法隨機分為正常對照組(對照組)、佐劑+CCP抗原組(模型組)、佐劑 +CCP抗原+寒濕環(huán)境組(寒濕組)、佐劑+CCP抗原+濕熱環(huán)境組(濕熱組)共4組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器

人工合成 CCP多肽，由岳泰公司提供;CCPELISA檢測試劑盒、AKA-ELISA檢測試劑盒、RFELISA檢測試劑盒均由歐盟公司提供;FPQ型多段人工氣候箱，購自寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制作 模型組:使用人工合成的CCP多肽抗原 100μg～150μg與完全福氏佐劑0.1ml混合后，注射一組大鼠雙側后肢足底部制備模型;寒濕組:免疫方法同模型組，并在接受免疫后第2天始，每天置于相對濕度95% ～100%、溫度7℃ ～10℃的環(huán)境中2h，連續(xù)刺激9d;濕熱組:免疫方法同模型組，并在接受免疫后第2天始，每天置于相對濕度 95% ～100%、溫度 30～33℃的環(huán)境中2h，連續(xù)刺激9d;對照組不做任何處理。

1.3.2 標本處理 以上各組均于實驗開始2周后尾尖取血1ml制備血清備用;4周后心臟穿刺取血4ml～6ml，制備血清備用;②造模后第4周末處死大鼠，取雙側后肢踝關節(jié)，多聚甲醛固定、脫鈣、脫水、浸臘、包埋、切片，HE染色后以備鏡下觀察。

1.3.3 觀察指標 雙側后肢跖趾厚度:使用千分卡尺分別測量大鼠雙側后肢跖趾厚度，取其雙側平均值。類風濕相關自身抗體檢測:包括類風濕因子(RF)(ELISA法)、抗角蛋白抗體(AKA)(間接免疫熒光法)、抗核周因子(APF)(間接免疫熒光法)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-CCP)(ELISA法)。病理學檢測:HE染色后鏡下觀察大鼠踝關節(jié)的關節(jié)結構變化情況。

圖1 大鼠后肢踝關節(jié)HE染色濕熱組

圖2 大鼠后肢踝關節(jié)HE染色寒濕組

圖3 大鼠后肢踝關節(jié)HE染色模型組

圖4 大鼠后肢踝關節(jié)HE染色對照組血清AKA表達情況

1.4 統(tǒng)計分析方法

所有資料均采用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行分析，等級資料采用秩和檢驗和ridit分析，計量資料用方差分析，各時間點比較采用具有一個重復測量的兩因素方差分析。

2 觀察結果

2.1 各時間點大鼠雙側后肢跖趾平均厚度比較

表 1 顯示，實驗各組在實驗前、6d、12d、18d、24d、28d等6個時間點大鼠雙側后肢跖趾厚度比較顯示，實驗前各組跖趾厚度無顯著性差異(P>0.05);其余5個時間點各組均值之間比較均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。組間兩兩比較顯示:從第6天開始，模型組、寒濕組和濕熱組在各個時間點均明顯高于對照組(P均<0.01);從第24天開始，寒濕組和濕熱組在各個時間點也均高于模型組(P均<0.05);但濕熱組和寒濕組之間無顯著性差異(P均>0.05)。組內兩兩比較顯示:對照組各個時間點之間均無顯著性差異(P均 >0.05);模型組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05);寒濕組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，第28天分別高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05);濕熱組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，第28天分別高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05)。

2.2 血清RF和抗CCP檢測結果

表2顯示，實驗2周末、4周末模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清RF水平均明顯高于對照組(P均<0.05);2周末寒濕組和濕熱組又均明顯高于模型組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);4周末模型組、寒濕組和濕熱組比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。

表2顯示，實驗2周末、4周末模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清CCP抗體滴度均明顯高于對照組(P均<0.05);2周末、4周末寒濕組和濕熱組又均明顯高于模型組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表 1 實驗前、6d、12d、18d、24d、28d 各組跖趾厚度檢測結果(mm，±s)

表 1 實驗前、6d、12d、18d、24d、28d 各組跖趾厚度檢測結果(mm，±s)

注:與對照組比較:★P<0.01;與模型組比較:▲P<0.05;與觀察前比較:■P<0.01;與第6天比較:#P<0.05;與第12天比較:◇P<0.05

時間(d)對照組(8) 模型組(8) 寒濕組(8) 濕熱組(8)實驗前4.35±0.24 4.52±0.15 4.46±0.29 4.35±0.34 6 4.43±0.25 6.76±0.99★■ 6.55±1.32★■ 6.63±0.82★■12 4.54±0.20 6.21±0.52★■ 6.50±0.31★■ 6.88±0.62★■18 4.61±0.29 7.11±0.75★■ 7.39±0.59★■ 7.48±0.33★■24 4.63±0.24 6.42±0.83★■ 7.39±0.44★▲■ 7.50±0.46★▲■28 4.89±0.27 6.40±0.33★■ 7.91±0.74★▲■#◇ 7.83±0.43★▲■#◇

表2 RF和抗CCP表達情況

圖5 濕熱組AKA(+++)

圖6 寒濕組AKA(++)

圖7 模型組AKA(+)

圖8 對照組AKA(－)

2.3 血清AKA表達情況檢測結果

表3顯示，實驗2周末、4周末，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清AKA的陽性率均明顯高于對照組(P均<0.05);4周末濕熱組血清AKA陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 血清APF表達情況檢測結果

表4顯示，實驗2周末、4周末，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清APF的陽性率均明顯高于對照組(P均<0.05);4周末濕熱組血清APF陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間無顯著性差異(P>0.05)。

注:與對照組比較:★P<0.05;與模型組比較:▲P<0.05;與寒濕組比較:#P<0.05

表4 2周末、4周末APF表達情況

2.5 病理學檢測結果

對照組:關節(jié)結構正常，滑膜組織無炎性細胞浸潤，滑膜細胞無增生，骨及軟骨結構正常;模型組:關節(jié)結構基本正常，滑膜細胞輕度增生，骨及軟骨結構基本正常;寒濕組:滑膜組織增生，可見3～4層排列不規(guī)則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏，髓腔擴大;濕熱組:滑膜細胞增生明顯，可見數層排列不規(guī)則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏、斷裂，排列不規(guī)則。

3 討論

中醫(yī)學認為，人體是一個有機整體，人和環(huán)境之間相互影響，也是一個不可分割的有機整體。《素問·六節(jié)臟象論》曰:“天食人以五氣，地食人以五味，五氣入鼻，藏于心肺，上使五色修明，音聲能彰;五味入口，藏于腸胃，味有所藏，以養(yǎng)五氣，氣和而生，津液相成，神乃自生?！薄端貑枴毭握摗吩?“人以天地之氣生，四時之法成”，說明自然環(huán)境乃人類生命賴以生存的源泉，同時人類作為整個物質世界的一部分，時刻受到自然環(huán)境變化的影響。正如《靈樞·邪客論》所言:“此人與天地相應者也?！鳖愶L濕關節(jié)炎屬中醫(yī)痹證范疇，正如《黃帝內經素問·痹論》中所說“風寒濕三氣雜至合而為痹也，其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹?！笨梢?，痹病與環(huán)境的關系尤為明顯?，F代醫(yī)學認為，雖然RA的病因在很大程度上還不明確，然而RA很可能是一種多因子疾病包括遺傳因素和環(huán)境因素。甚至有的學者認為，在RA發(fā)病過程中環(huán)境因素起了至關重要的作用，這種作用甚至超過遺傳因素。近年來隨著免疫學的進展，類風濕關節(jié)炎相關自身抗體的發(fā)現，對類風濕關節(jié)炎的早期診斷和預后都有很大幫助。多數學者認為，anti-CCP、APF、AKA的表達與類風濕關節(jié)炎關節(jié)破壞程度有關。然而，類風濕關節(jié)炎自身抗體的表達與中醫(yī)證候之間的關系如何?環(huán)境因素是否影響類風濕關節(jié)炎自身抗體的表達?本實驗在佐劑性關節(jié)炎模型的基礎上，用人工合成 CCP多肽抗原免疫動物，結合環(huán)境因素制作動物模型，觀察了不同環(huán)境下動物模型自身抗體表達的情況及關節(jié)破壞程度。

本研究顯示，①造模從實驗第6天起對大鼠后肢跖趾厚度具有非常顯著性影響，濕熱和寒濕環(huán)境更加重了對大鼠后肢跖趾厚度的影響，且隨著時間的推移，這種影響逐漸加重，但濕熱和寒濕環(huán)境之間無顯著性差異;②造模加寒濕或濕熱環(huán)境刺激能使大鼠血清RF水平顯著升高，但濕熱與寒濕環(huán)境之間比較無統(tǒng)計學差異;③造模加寒濕或濕熱環(huán)境刺激能使大鼠血清CCP抗體滴度顯著升高，但濕熱與寒濕環(huán)境之間比較無統(tǒng)計學差異;④造?；蛟炷＜雍疂窕驖駸岘h(huán)境刺激均能使大鼠血清AKA、APF陽性率明顯高于對照組，其中造模加濕熱環(huán)境的陽性率最高，造模加寒濕環(huán)境次之，但與單純造模無顯著性差異;⑤病理 HE染色顯示，模型組、寒濕組和濕熱組均可見關節(jié)滑膜細胞增生及炎性細胞浸潤，其中模型組最輕，濕熱組關節(jié)破壞最重，可見數層排列不規(guī)則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，寒濕組介于2組之間，

上述研究提示，寒濕和濕熱等環(huán)境因素影響了動物模型血清中 RF、anti-CCP、APF、AKA 的表達，加重了動物模型的自身免疫反應和關節(jié)炎的嚴重程度，其中濕熱環(huán)境的影響更為明顯。濕熱組關節(jié)破壞最重，RF、anti-CCP、APF、AKA 的表達均顯著增高或表達強陽性，特別是AKA和APF表達與關節(jié)破壞程度有關。從中可得出結論，寒濕和濕熱環(huán)境因素明顯影響了大鼠佐劑性關節(jié)炎的發(fā)病及嚴重程度，促進了疾病的發(fā)生，并加重了關節(jié)炎的病理進程。

本實驗顯示，寒濕和濕熱環(huán)境對大鼠跖趾厚度、自身抗體表達及關節(jié)破壞程度均有明顯影響，其中濕熱環(huán)境對大鼠血清AKA和APF影響及對關節(jié)破壞程度的影響更為嚴重，原因尚不清楚。但我們在實驗過程中發(fā)現，在寒濕環(huán)境中大鼠經常簇擁在一起取暖，這可能減緩了寒濕環(huán)境對其發(fā)病的影響，所以究竟寒濕和濕熱環(huán)境對RA發(fā)病的影響孰輕孰重，兩種環(huán)境對RA相關自身抗體表達的影響有何不同，兩種環(huán)境下的動物模型與中醫(yī)濕熱證和寒濕證是否一致，還有待進一步研究。

Effect of Environmental Factors on Expression of Autoantibody in Rats with Bi-Syndrome(Arthromyodynia)

SHEN Hong-bo1，BAI Yun-jing2，HU Yin-qi3
(1.Peking university third hospital，Beijing100191，China;2.The military general hospital of Beijing PLA，Beijing100700，China;3.Wangjing hospital of China academy of Chinese medical science，Beijing100102，China)

Objective:To study the impact of environmental factors on expression of autoantibodies in arthragia syndrome rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into control group，model group，damp-cold group or damp-heat group.In addition to the control group，the other 3 groups after modeling were put into different environmental for stimuli.Results:Compared with model group，the RF，APF and anti-CCP levels of both damp-heat group and damp-cold group showed statistically significant increase(P<0.05)，after both two and four weeks.Two weeks later，compared with model group，the AKA level of both damp-cold and damp-heat group showed statistically significant increases(P<0.05).4 weeks later，the AKA level had statistically significant increase compared with not only model group but also damp-cold group(P<0.05).The pathological results(4 weeks later)illustrated that the joint damage of rats from both damp-heat and damp-cold group were severer than that from model group and the joint damage of rats from damp-heat group were obviously the most serious.

rheumatoid arthritis，autoantibody，environmental factors，experimental study

R593.22

B

1006-3250(2010)09-0832-03

2010-03-17

申洪波(1966-)，男，山東濰坊人，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，從事中醫(yī)藥治療風濕免疫性疾病的臨床和實驗研究。Tel:010-82266267，18601227122，E-mail:shenhbo@yahoo.com.cn。