植物RNA病毒寄主因子基因的研究進(jìn)展

熊 偉

(1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南大理671000;2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005)

植物RNA病毒寄主因子基因的研究進(jìn)展

熊 偉1,2

(1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南大理671000;2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005)

文章綜述了植物RNA病毒寄主因子基因的研究進(jìn)展。

植物;RNA病毒;寄主因子基因

相對于寄主而言,病毒自身所攜帶的遺傳信息是非常有限的,即使是最大的病毒,其基因組也僅僅能編碼幾百個(gè)基因,不足寄主編碼基因的百分之一。病毒對寄主的成功侵染的絕大多數(shù)步驟都是在病毒與寄主因子的相互作用下進(jìn)行的。基因極其貧乏的RNA病毒不僅需要寄主因子提供其存活所必須適應(yīng)的基本環(huán)境,還需要寄主因子提供其可以直接利用的資源,寄主因子也因此在RNA病毒的侵染循環(huán)中扮演著重要的角色。對于植物RNA病毒,當(dāng)其穿過細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,便利用自身基因翻譯的一些成分與寄主細(xì)胞中已存在的一些因子相互作用從而啟動其自身RNA的復(fù)制,在細(xì)胞質(zhì)中不停地增殖?，F(xiàn)在認(rèn)為,寄主因子(Host Factors)是寄主細(xì)胞在病毒侵染過程(包括病毒入侵、病毒基因表達(dá)、病毒粒子裝配及釋放等)中寄主提供給病毒的一切便利條件,寄主細(xì)胞內(nèi)如果缺少這些寄主因子,病毒便不能復(fù)制或復(fù)制的效率大大降低[1]。

DNA病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可以利用寄主細(xì)胞的聚合酶,并受細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。但對RNA病毒而言,其基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中似乎較少依賴于植物細(xì)胞寄主因子的參與。因?yàn)檎婧松飪?nèi)并不存在相應(yīng)于RNA病毒復(fù)制的機(jī)制。曾經(jīng)認(rèn)為RNA病毒靠自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)即可完成其復(fù)制過程,支持這種觀點(diǎn)的現(xiàn)象是在RNA病毒復(fù)制的早期,寄主細(xì)胞基因的正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯常常被打斷。與此相悖的是RNA病毒明顯攜帶更小的基因組,其復(fù)制過程應(yīng)該更需要寄主因子的幫助。分離和純化這些在RNA病毒復(fù)制時(shí)起作用的寄主因子對了解病毒與寄主的相互作用以及闡明RNA病毒復(fù)制的分子機(jī)制十分重要。例如當(dāng)煙草花葉病毒TMV進(jìn)入植物寄主細(xì)胞后,其基因組編碼的復(fù)制酶便以正鏈ssRNA為模板合成負(fù)鏈RNA,再以負(fù)鏈RNA為模板合成正鏈RNA。單純的183 kD的TMV復(fù)制酶并不能有效地起始TMV的復(fù)制,它需要與寄主因子相結(jié)合形成復(fù)制酶復(fù)合體并結(jié)合在宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或微管上[2];因此,鑒別RNA病毒寄主因子基因并闡明功能也就成了病毒與宿主相互作用領(lǐng)域非常重要的研究前沿。本文將在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與RNA病毒復(fù)制有關(guān)的寄主因子基因綜述如下。

1 TOM基因家族

在擬南芥—煙草花葉病毒系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)的與TMV復(fù)制酶相結(jié)合的寄主因子主要是擬南芥TOM基因家族,包括At TOM1,A t TOM2,At-TOM3三個(gè)基因,目前已經(jīng)證實(shí)這三個(gè)基因與TMV基因組RNA的復(fù)制及亞基因組的mRNA合成相關(guān)。

1.1 A t TOM1基因

擬南芥A t TOM1基因是Ishikawa等[3]最早分離出來的,At TOM1基因突變株系用甲基磺酸乙酯(EMS)誘導(dǎo)擬南芥的種子獲得。接種病毒株TMV-Cg后,突變株P(guān)D114上TMV-Cg外殼蛋白的含量比野生型擬南芥的低。將TMV-Cg的RNA用電穿孔的方法導(dǎo)入PD114的原生質(zhì)體,與野生型相比,檢測到的TMV-Cg的正鏈RNA(包括基因組RNA和亞基因組mRNA)和外殼蛋白量相對減少。而亞基因組mRNA和外殼蛋白的減少趨于同步,說明只要存在mRNA,就可以以正常效率翻譯得到外殼蛋白,因此,可以推測At TOM1編碼的寄主因子作用的是病毒的基因組RNA在被侵染細(xì)胞中的有效復(fù)制。缺失TOM1基因雖能抑制TMV RNA的復(fù)制,但不影響擬南芥的正常生長發(fā)育。從擬南芥中克隆出的TOM1基因mRNA全長1369 bp(Genebank Accession No.AB016925),含一個(gè)長為876 bp的ORF,編碼291個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)由幾個(gè)高度疏水的區(qū)域組成。計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)表明,它是一個(gè)六次或七次跨膜的蛋白,N末端位于膜外,在第28～31位氨基酸與168～171氨基酸處有N-糖基化位點(diǎn)。這種蛋白可以與TMV編碼的解旋酶功能域相互作用,而TMV復(fù)制酶復(fù)合體與膜聯(lián)合在一起,推測A t TOM1編碼的跨膜蛋白作為膜的錨定物(membrane anchor)參與了復(fù)制酶復(fù)合體的形成[4]。

1.2 At TOM2基因

A t TOM2基因是Ohshima等[5]用快中子輻射的方法處理擬南芥的種子時(shí),獲得的抗TMV的擬南芥突變體。該突變體不同于用EMS處理的tom1突變體,它是由于另一位點(diǎn)TOM2基因發(fā)生突變。TOM2基因位于擬南芥1號染色體的中部區(qū)域,而TOM1基因位于擬南芥4號染色體的長臂。在TOM2基因發(fā)生突變的擬南芥原生質(zhì),接種TMV后,TMV RNA與CP的積累水平明顯比野生型的積累水平低,表明TOM2基因的產(chǎn)物也是TMV高效復(fù)制所必需的。最近的研究證實(shí)tom2突變株涉及到寄主基因組核酸大約20kb的缺失,缺失區(qū)域包括A t TOM2A、A t-TOM2B兩個(gè)基因,都與tom2突變株的表型有關(guān)。A t TOM2A編碼一個(gè)280氨基酸的跨膜蛋白質(zhì),At TOM2B編碼一個(gè)122氨基酸的基本蛋白質(zhì)。A t TOM2A與A t TOM1連在一起相互作用定位到擬南芥的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的,也是TMV復(fù)制復(fù)合體中的重要組成成分。

1.3 At TOM3基因

Yamanaka等[6]將TOM1基因突變的擬南芥突變體進(jìn)行二次突變,結(jié)果使TMV的復(fù)制幾乎完全被抑制。分析表明擬南芥的2號染色體上的一個(gè)位點(diǎn)TOM3基因發(fā)生了突變。TOM3基因全長cDNA ORF編碼301個(gè)氨基酸,與TOM1有56%的同源性,含有高度疏水的區(qū)域,也是7次跨膜的蛋白。推測TOM3也是細(xì)胞質(zhì)中膜結(jié)構(gòu)相結(jié)合蛋白質(zhì),它與TMV的復(fù)制蛋白相結(jié)合而使TMV RNA定位在膜上,便于TMV的高效復(fù)制。TOM3基因在病毒復(fù)制過程中與TOM1基因起同等重要的作用。

TOM基因家族中的另一個(gè)成員是T H H1基因[7](TOM3 Homolog),它也與RNA病毒的復(fù)制有關(guān)。

2 幫助病毒在寄主細(xì)胞間移動的寄主基因

病毒在寄主細(xì)胞間的移動需要病毒編碼的運(yùn)動蛋白(movement protein,MP)以及寄主編碼的因子的參與才能實(shí)現(xiàn)。在擬南芥中,蕪菁脈明病毒(Turnip vein clearing virus,TVCV)在VSM1基因發(fā)生突變的植株中不能像在野生型植株那樣能在整株中擴(kuò)散。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),VSM1基因發(fā)生突變的植株能有效地阻斷病毒從接種部位進(jìn)入植物運(yùn)輸水分及養(yǎng)分的導(dǎo)管。但是VSM1基因發(fā)生突變的植株只能阻止煙草花葉病毒屬的病毒進(jìn)入導(dǎo)管,而不能阻止香石竹斑駁病毒屬(Carmovirus)的病毒進(jìn)入植株的導(dǎo)管,意味著不同屬的病毒需要不同的寄主因子的參與下才能進(jìn)入導(dǎo)管從而擴(kuò)散到植株的其他部位[8]。Matsushita等[9]在煙草中鑒定了一種轉(zhuǎn)錄激活子MBF1,它能與煙草運(yùn)動蛋白相結(jié)合而調(diào)節(jié)煙草的基因表達(dá)使病毒能在細(xì)胞間長距離運(yùn)輸。在擬南芥中也分離出多種基因(CUM1,CUM2-1),其編碼的產(chǎn)物與病毒運(yùn)動蛋白相互作用而介導(dǎo)病毒在寄主細(xì)胞與細(xì)胞之間的運(yùn)輸。Chen等[10]利用蛋白質(zhì)的相互作用從TMV感染的煙草中檢測到一種煙草細(xì)胞壁中分子量約為38 kD的蛋白,并純化了這種蛋白,鑒定為PME(Pectin Methylesterase)。它能與TMV MP的一定區(qū)域相結(jié)合而使TMV能在胞間擴(kuò)散,如果MP缺失這一區(qū)域而不能與PME相結(jié)合,則TMV不能在胞間擴(kuò)散。同樣,如果細(xì)胞中沒有PME,TMV也同樣不能在胞間擴(kuò)散。植物中這種基因能編碼阻止或減緩這種運(yùn)動的蛋白質(zhì),因此,它對病毒具有廣譜抗性。另外,在用TEV篩選擬南芥突變株時(shí),發(fā)現(xiàn)突變RTM1或RTM2,TEV就失去了在植株中系統(tǒng)移動的能力。

3 真核生物翻譯啟始因子3(eIF3)

大量的遺傳及生物化學(xué)信息表明,寄主蛋白也是植物RNA病毒復(fù)制復(fù)合體的一部分,如TMV、BMV、黃瓜花葉病毒(CMV)、豇豆花葉病毒(CoMV)、紅三葉死花葉病毒(RCNMV)和蕪菁花葉病毒(TYMV)等多種病毒的RdRp至少與一種寄主蛋白共純化。然而,絕大多數(shù)寄主蛋白本身的性質(zhì)及其在病毒復(fù)制過程中的作用還不甚清楚。不過,有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,真核生物翻譯啟始因子3(eukaryotic translation initiation factor 3,eIF3)在TMV、BMV的復(fù)制過程中起到重要的作用。

Osman等[11]和Wahanabe等[12]發(fā)現(xiàn)從被侵染的馬鈴薯葉片中分離到的TMV RdRp包含幾種寄主蛋白,其中有一種56 kD的蛋白與酵母的eIF3中的GCD10亞基存在血清學(xué)相關(guān)性。GCD10蛋白的抗體可抑制RdRp作用下的TMV基因組RNA及雙鏈RNA的合成;如果預(yù)先加入純化的GCD10蛋白,則GCD10蛋白的抗體不降低TMV基因組RNA及雙鏈RNA的合成效率,表明這種類似GCD10亞基的蛋白與TMV的復(fù)制有關(guān)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中,酵母eIF3的GCD10亞基與TMV的126/183 kD復(fù)制酶蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶功能域進(jìn)行選擇性相互作用,進(jìn)一步證實(shí)了GCD10亞基參與TMV RNA復(fù)制這一結(jié)論[13]。

從被侵染的大麥中提取的BMV RNA聚合酶包含一種大麥蛋白,這種大麥蛋白與小麥胚eIF3 41kD基因存在血清學(xué)關(guān)系,與BMV的2a蛋白有高度的親和力和專化性,而且加入小麥胚eIF3或來自小麥胚的41 kD亞基時(shí),RdRp能在體外特異性合成BMV的負(fù)鏈RNA,復(fù)制能力提高3倍。在活體內(nèi),與eIF3 41kD亞基同源的蛋白與BMV的RdRp結(jié)合在一起,并參與BMV RNA的復(fù)制[14]。與BMV RdRp結(jié)合的45 kD大麥蛋白和TMV復(fù)制酶復(fù)合體的56 kD馬鈴薯蛋白分別與eIF3不同的亞基相對應(yīng),說明這兩種寄主蛋白之間無同源關(guān)系,并在各自病毒的復(fù)制過程中起不同的作用。

4 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因(SA H H)

SA H H基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)與S-腺苷甲硫氨酸的比例來控制生物的甲基化反應(yīng)。DNA與蛋白質(zhì)的甲基化與去甲基化在許多生物的信號傳導(dǎo)中扮演著十分重要的作用。另外,SAHH也可能通過調(diào)節(jié)SAH/SAM的比例來控制mRNA 5’端帽子的甲基化。抑制細(xì)胞內(nèi)SAHH的活性可能會降低宿主mRNA或病毒mRNA 5’端甲基化帽子的甲基化程度。實(shí)際上,SAHH是一種很有效的抗動物病毒的抑制劑,也能抑制植物病毒的復(fù)制[15]。Chikara等[16]將SA H H基因反義轉(zhuǎn)入煙草中,獲得部分抗TMV的植株,TMV在轉(zhuǎn)基因煙草中的局部壞死斑更少更小,對其他煙草也能推遲系統(tǒng)感染的時(shí)間。同時(shí),轉(zhuǎn)SA H H的部分煙草也能抗CMV與PVX。接種CMV后,產(chǎn)生系統(tǒng)性感染的時(shí)間明顯推遲,接種PVX 2個(gè)月后,都未能有可見癥狀,說明利用反義抑制SAHH基因能提高植物的抗病毒能力。但轉(zhuǎn)SAHH基因的煙草有一半表現(xiàn)生長改變,甚至有的出現(xiàn)生長輕微矮化。SA H HcDNA為1818 bp(GeneBank Accession No.D45204),編碼產(chǎn)生由485個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

5 真核生物延長因子1A基因(eEF1A)

TMV的RNA基因的3’端缺少Poly(A)的結(jié)構(gòu),而具有類tRNA結(jié)構(gòu)。此類tRNA結(jié)構(gòu)對TMV RNA的翻譯復(fù)制具有重要的作用,它能與宿主延長因子1A(eEF1A)相結(jié)合而啟動TMV RNA負(fù)鏈的合成,提高TMV RNA的復(fù)制效率[17],如果能降低寄主細(xì)胞內(nèi)的延長因子1A基因的表達(dá)水平就有可能抑制TMV的復(fù)制。通過轉(zhuǎn)入外源的延長因子1A基因來沉默內(nèi)源的延長因子1A基因,從而獲得抗TMV的植株。

6 其他已發(fā)現(xiàn)的與病毒復(fù)制有關(guān)的植物寄主因子

除了上述已介紹的一些植物寄主因子外,發(fā)現(xiàn)蕪菁黃花葉病毒的復(fù)制與寄主EF-1α、elF3和Tubulin有關(guān)[18],這些寄主因子基因是否能用于構(gòu)建抗病毒植物仍需進(jìn)一步研究。

7 問題與展望

自從1986年P(guān)owell等將TMV的外殼蛋白基因?qū)霟煵?獲得第一例抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草以來,又有許多抗病毒基因工程策略應(yīng)用于植物,成為防治植物病毒病的主要方法。一種方法是將來源于病毒自身的基因或基因的調(diào)控序列導(dǎo)入受體植物,從而獲得病毒起源抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株,但是利用這種方法得到的抗病毒植株一般表現(xiàn)為垂直抗病性,而且,將來源于病毒的基因轉(zhuǎn)入植物而使植物獲得抗病毒的能力這一方法存在潛在的危險(xiǎn)因素;另一種方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)來獲得抗病毒植物。

研究植物RNA病毒的寄主因子能進(jìn)一步揭示RNA病毒復(fù)制的分子機(jī)制,同時(shí)為提出新的抗病毒策略提供理論依據(jù)。如At TOM1和At-TOM3等基因突變后,突變株在常規(guī)的栽培管理?xiàng)l件下正常生長,而煙草花葉病毒(TMV)復(fù)制受抑制,使得通過誘變寄主因子基因獲得抗病毒(或耐病毒)植株成為可能;另有研究發(fā)現(xiàn),黃瓜花葉病毒(CMV)在擬南芥細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,必須依賴于CUM1及CUM2基因[19]。對寄主因子的研究為抗病毒基因工程提供了一條新的途徑,即將寄主細(xì)胞中支持RNA病毒復(fù)制的基因敲除或沉默,使其提供不了病毒復(fù)制所需的條件,從而達(dá)到獲得廣譜性抗病毒植株的目的。相信隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟,不久的將來會有越來越多的植物RNA病毒寄主因子基因被發(fā)現(xiàn),利用基因沉默技術(shù)抑制寄主因子基因能培育出大量新型的抗病毒種質(zhì)。

[1] Kariainen L.Function of alphavirus nonstructural proteins in RNA replication[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2002,71:187-222.

[2] 徐耀先,周曉峰,劉立德.分子病毒學(xué)[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2000.

[3] Ishikawa M,Naito S,Ohno T,et al.Effects of the TOM1 mutation ofA rabidopsis thalianaon the multiplication of tobacco mosaic virus RNA in protoplasts[J].Journal of Virology,1997,67:5328-5338.

[4] Hagiwara Y,Komoda K,Yamanaka T,et al.Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication[J].EMBO J,2003,22(2):344-353.

[5] Ohshima K,Taniyana T,Yamanaka T,et al.Isolation of a mutant ofA rabidopsis thlianacarrying two simultaneous mutations affecting tobacco mosaic virus multiplication within a single cell[J].Virology,1998,243:472-481.

[6] Yamanaka T,Ohta T,Takahashi M,et al.TOM1,anA rabidopsisgene required for effiicient multiplication of a tobamovirus,encodes a putative transmembrane protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:10107-10112.

[7] Yamanaka T,Imai T,Satoh R,et al.Complete inhibition of tabamovirus multiplication by simultaneous mutations in two homologous host genes[J].Journal of Virology,2002,76:2491-2497.

[8] Lartey R T,Ghoshroy S,Citovsky V,et al.Identification of anA rabidopsis thalianamutation(vsm1)that restricts systemic movement of tobamoviruses[J].Mol Plant Microbe Interact,1998,11(7):706-709.

[9] Matsushita Y,Miyakawa O,Deguchi M,et al.Cloning of a tobacco cDNA coding for a putative transcriptional coactivator MBF1 that interacts with the tobacco mosaic virus movement protein[J].Journal of Experimental Botany,2002,53:1531-1532.

[10] Chen M H,Sheng J S,Geoffrey H,et al.Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement[J].EMBO J,2000,19:913-920.

[11] Osman T A,Buck K W.The tobacco mosaic virus RNA polymerase complex contains a plant protein related to the RNA-binding subunit of yeast eIF-3[J].Journal of Virology,1997,71:6075-6082.

[12] Wahanabe T,Honda A,Ueda S,et al.Isolation from tobacco mosaic virus-infected tobacco of a solubilizedtemplate-specific RNA-dependent RNA polymerase containing a 126k/183k protein heterodimer[J].Journal of Virology,1999,73:2633-2640.

[13] Taylor D N,Carr J P.The GCD10 subunit of yeast eIF-3 binds the methyltransferase-like domain of the 126 and 183 kD replicase proteins of tobacco mosaic virus in the yeast two-hybrid system[J].Journal of General Virology,1995,81:1587-1591.

[14] Quadt R,Jaspars E M J.Purification and characterization of brome mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase[J].Virology,1990,178:189-194.

[15] Bethin K E,Cimato T R,Ettinger M J.Copper binding to mouse liver S-adenosylhomocysteine hydrolase and the effects of copper on its levels[J].J Biol Chem,1995,9:270-275.

[16] Masuta C,Tanaka H,Uehara K,et al.Broad resistance to plant viruses in transgenic plant conferred by antisense inhibition of a host gene essential in S-adenosylmethionine-dependent transmethylation reactions[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6117-6119.

[17] Vladimir V,Zeenko,Lyubov A,et al.Eukaryotic elongation 1A interacts with the upstream pseudoknot domain in the 3’-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA[J].Journal of Virology,2002,76(11):5678-5691.

[18] Anderson J M,Palukaitis P,Zaitlin M,et al.A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:8759-8763.

[19] Yoshii M,Yoshioka N,Ishikawa M,et al.Isolation of anA rabidopsis thalianamutant in which the multiplication of both cucumber mosaic virus and turnip crinkle virus is affected[J].Journal of Virology,1998,72:8731-8737.

Abstract:This paper reviews the research advances of RNA virus host factor gene in plant.

Key Words:plant;RNA virus;host factor gene

The Research Advances of RNA Virus Host Factor Gene in Plant

Xiong Wei1,2
(1.College of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan671000,China;2.College of Lif e Science and Technology,Guangxi University,N anning,Guangxi530005,China)

Q75;S432.4+1

A

1671-2544(2010)03-0015-05

2010-02-19

熊 偉(1982— ),男,湖南株洲人,大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院講師,云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生。

(責(zé)任編輯:陳錦華)