膜聯(lián)蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展

鄔 強(qiáng) 綜述，錢(qián)士勻 審校

（海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

膜聯(lián)蛋白亦稱(chēng)為鈣磷脂結(jié)合蛋白，是一類(lèi)依賴(lài)Ca2+的膜磷脂結(jié)合蛋白超家族，廣泛分布于各種真核細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外，約占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的2%左右[1]。其家族各成員結(jié)構(gòu)上具有極高的同源相似性，C端均由約70個(gè)氨基酸殘基組成的4個(gè)(Annexin A6為8個(gè))保守重復(fù)序列，構(gòu)成獨(dú)特的Ca2+-膜結(jié)合中心結(jié)構(gòu)域，使之可逆性錨定于細(xì)胞膜上。家族中不同的膜聯(lián)蛋白成員N端序列長(zhǎng)度不同，各具獨(dú)特的基因表達(dá)方式和組織特異性，表明特異的N端區(qū)域與各種膜聯(lián)蛋白的特異功能有關(guān)[2]。膜聯(lián)蛋白更易于與酸性磷脂結(jié)合，尤其是磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸，不同的膜聯(lián)蛋白在機(jī)體的不同組織和部位執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。

1 膜聯(lián)蛋白家族組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

自1977年膜聯(lián)蛋白首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其家族成員不斷增加，現(xiàn)有超過(guò)1000種不同的基因表達(dá)產(chǎn)物組成，廣泛存在于不同門(mén)、種的大多數(shù)真核生物細(xì)胞（動(dòng)物、植物、真菌）中，物種間高度保守[3]。目前膜聯(lián)蛋白超家族可以分為A、B、C、D、E 5個(gè)家族，A族主要存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞，已確定有12個(gè)成員(Annexin A1-A11，Annexin A13)。人膜聯(lián)蛋白基因大小從15 kb(Annexin A9)到96 kb(Annexin A10)不等，定位于1、2、4、5、8、9、10及15號(hào)染色體上。大多數(shù)家族成員分布于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜，而Annexin A1、Annexin A2及Annexin A5等也在細(xì)胞外有發(fā)現(xiàn)，如存在于血液中[4]。由于缺乏信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，膜聯(lián)蛋白如何轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的機(jī)制尚不清。

膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)上包括C端中心結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域。X射線(xiàn)晶體衍射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中心結(jié)構(gòu)域大多由5個(gè)α螺旋形成的圓盤(pán)狀結(jié)構(gòu)組成，凸面包含膜磷脂結(jié)合位點(diǎn)及2個(gè)典型的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，面向細(xì)胞膜。不同膜聯(lián)蛋白的中心結(jié)構(gòu)域大約有50%的氨基酸序列同源。N端位于圓盤(pán)結(jié)構(gòu)的凹面，游離延伸與中心結(jié)構(gòu)域相互作用，調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。影響Ca2+依賴(lài)的圓盤(pán)凸面與帶負(fù)電荷的膜磷脂結(jié)合，另外還包括蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)及細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，為膜聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)。在未結(jié)合Ca2+時(shí)，N端藏于中心結(jié)構(gòu)域內(nèi)，結(jié)合Ca2+后，N端暴露于分子外[5]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外通過(guò)基因抑制(Gene Knockdown)、基因敲除(Gene Knockdown)、RNA干擾(RNA Interference)及顯負(fù)性突變體(Dominant negative mutant)等方法研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白具有多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞中參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴(lài)于鈣調(diào)節(jié)蛋白的活動(dòng)，包括囊泡運(yùn)輸、胞吐作用中的膜融合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣離子通道的形成、調(diào)控炎性反應(yīng)，參與凝血過(guò)程，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用等[6]。膜聯(lián)蛋白與人類(lèi)許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，尤其在心血管疾病、腫瘤、炎癥、糖尿病及自身免疫病中的作用機(jī)制成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。某些膜聯(lián)蛋白的表達(dá)和活性失調(diào)可以引起人類(lèi)多種疾病，并可導(dǎo)致“膜聯(lián)蛋白病”。目前每種膜聯(lián)蛋白的具體生物學(xué)功能尚不十分清楚。

2 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制

AS及其并發(fā)癥是當(dāng)今世界上導(dǎo)致死亡的最常見(jiàn)的病因之一，是由多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。AS的發(fā)生發(fā)展包括脂質(zhì)入侵、血小板活化、內(nèi)膜損傷、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管平滑肌細(xì)胞激活、血栓形成、選擇性基質(zhì)代謝及血管重建等[7]。AS發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，但均不能單獨(dú)徹底闡明其確切病因及發(fā)病機(jī)制。

近年來(lái)多數(shù)學(xué)者接受“AS是一種多因素導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)性疾病”的學(xué)說(shuō)，即“炎癥誘發(fā)的內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為AS形成的基本過(guò)程為：在長(zhǎng)期高脂血癥的影響下，增多的脂蛋白尤其是氧化修飾的低密度脂蛋白和膽固醇對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜造成功能性損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面發(fā)生特征性改變，粘附分子表達(dá)增加，使單核細(xì)胞粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)量增多，并從內(nèi)皮細(xì)胞之間遷移至內(nèi)膜下成為巨噬細(xì)胞，通過(guò)清道夫受體吞噬氧化的低密度脂蛋白后，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，形成最早的粥樣硬化病變脂質(zhì)條紋，同時(shí)平滑肌細(xì)胞纖維化增生，促使脂質(zhì)條紋演變成纖維脂肪病變，最終發(fā)展成為纖維斑塊，即AS斑塊，使動(dòng)脈壁變硬、管腔狹窄[8]。AS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程都有炎性因素的參與，存在一系列炎癥級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)，炎癥細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附并遷移至內(nèi)皮下演變?yōu)榫奘杉?xì)胞是AS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[9]。

細(xì)胞凋亡是AS病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，貫穿于AS發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的平衡決定了AS的進(jìn)展，其參與了血管內(nèi)皮的損傷、血栓的形成和平滑肌細(xì)胞凋亡后的纖維化所致肌層的增厚、血管重建以及細(xì)胞凋亡后AS斑塊的脫落等病理改變。細(xì)胞凋亡直接影響粥樣硬化動(dòng)脈的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及AS斑塊的穩(wěn)定性。AS斑塊內(nèi)細(xì)胞過(guò)度凋亡，在促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成的過(guò)程中起著重要的作用[10]。

3 膜聯(lián)蛋白與AS的關(guān)系

Annexin A1又稱(chēng)為脂皮素(LipocotinⅠ)、依鈣蛋白(CalpactinⅡ)、磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)抑制蛋白，在機(jī)體多數(shù)組織尤其是粒細(xì)胞、單核細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Annexin A1是一個(gè)重要的炎癥調(diào)控蛋白，在炎性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的過(guò)程中起重要作用[11]。在炎癥反應(yīng)中Annexin A1對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移都有強(qiáng)大的抑制效應(yīng)，這一作用與甲?；氖荏w(FPR)和Lipoxin A4受體(ALXR)的激活、L-選擇素(L-Selectin)的脫落、整合素(Integrin)α4β1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和N-聚糖羧化有關(guān)[12]。外源性Annexin A1以及內(nèi)源性Annexin A1外化與血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)競(jìng)爭(zhēng)與整合素α4β1結(jié)合，抑制單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，參與早期炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[13]。Annexin A1的抗炎癥作用還主要體現(xiàn)在它對(duì)PLA2的抑制作用，PLA2是炎性介質(zhì)合成釋放的關(guān)鍵酶，是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的中心[14]。Annexin A1也抑制其他一些參與炎癥反應(yīng)的酶表達(dá)和活性，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶2等[15]。他汀類(lèi)藥物可以影響外周血單核細(xì)胞抗炎蛋白Annexin A1的表達(dá)，隨著其劑量增加Annexin A1表達(dá)水平顯著增加，發(fā)揮其抗炎作用，并進(jìn)一步發(fā)揮抗AS作用。Annexin A1表達(dá)的改變能夠影響caspase-3的活化和Ca2+釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。外源性的Annexin A1可通過(guò)提高胞內(nèi)Ca2+濃度和相關(guān)凋亡促進(jìn)因子的去磷酸化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。

Annexin A2蛋白主要表達(dá)在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中，在細(xì)胞膜構(gòu)架的形成、膜聚合、內(nèi)吞和胞吐過(guò)程中均起重要作用，還參與多種病理過(guò)程。細(xì)胞表面的Annexin A2蛋白可作為受體，參與纖溶、細(xì)胞粘附、配體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病毒感染等生理過(guò)程。Annexin A2蛋白在細(xì)胞膜表面結(jié)合組織纖維蛋白溶解酶原激活因子和纖溶酶原，介導(dǎo)纖溶蛋白酶的生成，增強(qiáng)纖溶酶催化效率，影響凝血機(jī)制[17]。通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶活性，降低血液黏稠度及AS的發(fā)生率。另外有研究表明，在H2O2或腫瘤壞死因子α(TNF-α)引起的過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)中，Annexin A2是胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)谷胱甘肽化的主要靶點(diǎn)。Ling等人研究發(fā)現(xiàn)Annexin A2的異四聚體還具有還原纖維蛋白溶酶的活性，可通過(guò)破壞纖溶酶原中的二硫鍵使其釋放A61片段[18]。AS發(fā)展過(guò)程中，由于脂蛋白(a)的影響，Annexin A2促纖溶作用減弱；脂蛋白(a)含纖溶酶樣載脂蛋白A，可結(jié)合低密度脂蛋白；脂蛋白(a)抑制纖溶酶原結(jié)合到Annexin A2分子上，降低纖溶酶產(chǎn)生，導(dǎo)致纖維蛋白溶解障礙，促使進(jìn)行性AS的發(fā)生。同型半胱氨酸可競(jìng)爭(zhēng)性抑制組織纖維蛋白溶解酶原激活因子與Annexin A2的結(jié)合，從而減少纖溶酶的產(chǎn)生，影響正常纖溶而使體內(nèi)形成血栓[19]。Annexin A2也具有Annexin A1對(duì)PLA2的抑制作用而抗炎癥，且四聚體形式的抑制作用更強(qiáng)。

Annexin A5最早由胎盤(pán)中分離得到，具有與Annexin A2同樣的抗凝及抗炎癥作用。Annexin A5抗凝功能主要通過(guò)有序地排列在細(xì)胞膜磷脂表面，形成屏障陣列，遮蓋血液凝固所需的磷脂，并可以從磷脂表面轉(zhuǎn)移凝血因子。一旦Annexin A5在細(xì)胞磷脂膜表面形成的這一屏障被破壞，則容易發(fā)生血液凝固。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜表面暴露磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)，為血液凝固提供了催化表面，從而加速血栓形成[20]。Annexin A5是抗磷脂抗體所針對(duì)的重要自身靶抗原之一，抗磷脂綜合征(APS)血栓形成機(jī)制的研究表明，Annexin A5與帶陰離子的磷脂結(jié)合，抑制了磷脂依賴(lài)凝血復(fù)合物的形成，而抗磷脂抗體對(duì)Annexin A5的識(shí)別，導(dǎo)致Annexin A5與磷脂之間親和力的下降，加速凝血，促進(jìn)血栓形成[21]。在Ca2+存在的條件下，Annexin A5對(duì)PS具有高度親和力，作用位點(diǎn)是第187位的色氨酸。PS從細(xì)胞膜的脂雙層內(nèi)層遷移至外層是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初始事件，利用兩者這種高親和力特性，很多研究者將標(biāo)記有熒光素(如FITC、PE)或生物素的Annexin A5作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞的發(fā)生[22]，而且利用放射性示蹤技術(shù)對(duì)Annexin A5進(jìn)行放射性核素標(biāo)記后(常用碘或99mTc)，通過(guò)與PS的結(jié)合可非侵入活體檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用于檢測(cè)AS的發(fā)生[23]。這個(gè)中間物質(zhì)呈像的技術(shù)可以定量反映AS斑塊的組成、代謝及發(fā)展趨勢(shì)，可早期發(fā)現(xiàn)AS的發(fā)生，采取措施控制AS的進(jìn)一步發(fā)展。

Annexin A7在體外能聚集嗜鉻顆粒，因而是第一個(gè)被分離的膜聯(lián)蛋白家族成員。除腎上腺髓質(zhì)外，已在許多哺乳動(dòng)物組織中檢測(cè)到Annexin A7，包括腦、肝臟、腮腺、脾、肺及骨骼肌。Annexin A7參與膜運(yùn)輸、細(xì)胞分泌、鈣離子動(dòng)態(tài)平衡及腫瘤抑制等多種生物學(xué)功能。凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Annexin A7的含量降低，在凋亡因子刺激下Annexin A7的下調(diào)可阻止半乳凝素-3發(fā)揮抗凋亡作用[24]。

4 結(jié)論

盡管膜聯(lián)蛋白具有多種生物學(xué)功能，但除Annexin A1在炎癥，Annexin A2在糖尿病中的作用機(jī)制，大多具體機(jī)制尚不清晰。目前尚無(wú)疾病證明直接與特定的膜聯(lián)蛋白功能喪失有關(guān)，但其必定在多種疾病及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在AS的發(fā)生、發(fā)展中，膜聯(lián)蛋白很可能參與了多個(gè)過(guò)程，但需要進(jìn)行大量的研究來(lái)闡明其具體機(jī)制。相信這些“老分子”必將成為AS研究領(lǐng)域的“新角色”。

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