微小RNA與腫瘤診斷

王秀宏

(天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津 武清 301700）

微小RNA（miRNA或miR）是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。迄今為止，已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中鑒定出800多種miRNA，它們在細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等多種生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［1-2］。miRNA的異常表達(dá)與各種類型惡性腫瘤（包括血液源性惡性腫瘤）的發(fā)生密切相關(guān)，在不同類型腫瘤有特征性的表達(dá)。大約50%的miRNA定位于基因組與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)（FRA）上，這些miRNA所起的作用類似于抑癌基因和癌基因[3]。深入理解miRNA在腫瘤中的作用，對其早期診斷及建立有效的miRNA靶向治療具有重要意義。

1 miRNA的生成及作用機(jī)制

目前人類miRNA的生物合成已得到較為詳盡的闡述。首先，在細(xì)胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或聚合酶［3］轉(zhuǎn)錄成較長的（100～1000個(gè)核苷酸）含有5’7-甲基鳥苷帽子及3’polyA尾的初級轉(zhuǎn)錄物（Pri-miRNA）；而后，Pri-miRNA被RNaseIII型核酸內(nèi)切酶Drosha及其輔酶DGCR8加工成約70個(gè)核苷酸的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體（Pre-miRNA），隨后由GTP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)之中。細(xì)胞質(zhì)中的前體被另一種RNaseIII型核酸內(nèi)切酶Dicer及其輔助因子TRBP/PACT剪切掉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成約22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA［4］。其中的一條鏈在Argonautes蛋白引導(dǎo)下進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），成為成熟miRNA，同時(shí)另一條鏈降解。

成熟miRNA通過與特異的靶mRNA3’UTR（3’非翻譯區(qū)）核酸序列互補(bǔ)結(jié)合，對靶基因產(chǎn)生調(diào)控。其作用方式有兩種：靶向降解mRNA和抑制靶mRNA翻譯，到底產(chǎn)生哪種作用主要取決于miRNA與靶mRNA互補(bǔ)作用［5］。前者是靶向特異的miRNA分子與胞質(zhì)中的核酸內(nèi)外切酶、解旋酶等一起構(gòu)成RISC，對靶mRNA進(jìn)行切割，發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，該機(jī)制要求miRNA與靶mRNA嚴(yán)格互補(bǔ)；而抑制翻譯機(jī)制，則是miRNA序列與mRNA3’UTR序列結(jié)合，抑制核糖體功能，從而抑制相應(yīng)mRNA的翻譯過程［5］，該機(jī)制不需要嚴(yán)格互補(bǔ)，只要miRNA序列與靶向mRNA3’UTR序列部分互補(bǔ)結(jié)合，就可發(fā)揮作用，這種方式不影響靶mRNA的穩(wěn)定性，只影響蛋白表達(dá)水平。該機(jī)制的存在使一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因也可受多種miRNA的調(diào)節(jié)，使得調(diào)節(jié)機(jī)制更加復(fù)雜。在與靶基因識別過程中，miRNA5’端2～8個(gè)核苷酸幾乎無一例外地能與靶mRNA3’UTR完全互補(bǔ)，在特異識別靶mRNA中起關(guān)鍵作用，被稱為“種子序列”。雖然絕大部分研究集中于miRNA介導(dǎo)的基因沉默，但Vasudevan等［6］的研究顯示miRNA也可以促進(jìn)翻譯過程。他們發(fā)現(xiàn)，在饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞周期G1捕獲期間，miR369-3和人工合成的miRNA模擬CXCR可以增強(qiáng)mRNA翻譯，而在其他細(xì)胞周期抑制翻譯。這一研究無疑拓寬了miRNA對蛋白表達(dá)的作用，而且也增加了miRNA應(yīng)用的復(fù)雜性。有研究顯示miRNA還可去掉mRNA的poly-A尾從而加速靶向mRNA的降解，不需要二者堿基的嚴(yán)格配對［7］，并有可能產(chǎn)生“旁觀者效應(yīng)”，加速其他mRNA的降解。

2 miRNA參與腫瘤病理過程的機(jī)制

2.1 激活癌基因或沉默抑癌基因 miRNA-221/222在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中miRNA-221以腫瘤抑制因子P27基因?yàn)榘悬c(diǎn)，轉(zhuǎn)錄后沉默其mRNA翻譯過程，下調(diào)其功能表達(dá)［8］。P27是腫瘤抑制因子，在腫瘤中的表達(dá)通常被破壞，其缺失可增加腫瘤的發(fā)生率和增長率。P27的表達(dá)水平下降與腫瘤進(jìn)展及腫瘤患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)［9］。P16基因抑制周期素依賴性蛋白激酶4活性，維持PRB基因的低磷酸化，而使細(xì)胞分裂停留在G1期，在腫瘤組織中P16呈普遍的低表達(dá)狀態(tài)。報(bào)道顯示，在宮頸癌細(xì)胞株中miRNA-24與P16表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，失活miRNA-24的表達(dá)可增加P16基因表達(dá)水平，并且miRNA-24的5’端“seed sequence”序列與P16 mRNA的3′端UTR區(qū)互補(bǔ)，認(rèn)為miRNA-24下調(diào)P16水平而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生［10］。

2.2 調(diào)控凋亡基因 miRNA-15a/16-1可通過干擾BCL-2 mRNA增加腫瘤細(xì)胞凋亡活性，引起腫瘤細(xì)胞死亡。Lu Z等也發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，miRNA-21表達(dá)升高并可通過沉默程序化細(xì)胞死亡4基因的mRNA促進(jìn)細(xì)胞增殖［11］。Wang等研究證實(shí)，攜帶致瘤基因HPV的宮頸癌組織和Caski，SiHa，HeLa，C411，ME180細(xì)胞株中顯示腫瘤抑制基因miR-34a的表達(dá)減少。在器官組織中miR-34a表達(dá)的減少源于包含HPV的人類角質(zhì)化細(xì)胞的早期生產(chǎn)階段中病毒E6蛋白的表達(dá)，E6的表達(dá)影響腫瘤抑制因子P53（一種miR-34a的轉(zhuǎn)錄因子）。在HPV16（+）和HPV18（+）子宮頸癌細(xì)胞系中，E6的表達(dá)導(dǎo)致P53和miR-34a表達(dá)的增加。在HPV（+）Hela細(xì)胞和HPV（-）HCT116細(xì)胞中，miR-34a的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育遲緩和適度的細(xì)胞凋亡。這是首次證明一種病毒致瘤蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞miRNA的表達(dá)［12］。

2.3 細(xì)胞黏附 E-鈣黏蛋白主要在乳腺癌中被廣泛研究，有報(bào)道m(xù)iRNA-9可通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的侵蝕轉(zhuǎn)移能力［13］。

2.4 誘導(dǎo)血管生成 一些miRNA分子可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、環(huán)氧化酶2等改變腫瘤細(xì)胞的血管生長能力［14］。

2.5 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵蝕能力 miRNAs除了在促使原始腫瘤的發(fā)生過程中起作用外，同時(shí)還在腫瘤的進(jìn)展包括致命性的腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤細(xì)胞的浸潤是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，而上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）在浸潤過程中起重要作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)移生長因子（TGF-β）、轉(zhuǎn)錄因子Snail、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及病毒癌基因可以誘導(dǎo)EMT；腫瘤細(xì)胞EMT與腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都有關(guān)系。研究腫瘤細(xì)胞EMT將為尋找抗腫瘤治療新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

Tavazoie等微陣列芯片篩選了多個(gè)具有高度轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌MDA-MB-231衍生細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)一系列miRNA的異常表達(dá)與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中mir-335和mir-126對抑制腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮著關(guān)鍵性作用；這兩種miRNA表達(dá)缺失的乳腺癌患者生存率低。該試驗(yàn)表明miRNAs在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［15］。

miR-10b是Twist 1基因的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，而Twist 1是誘導(dǎo)EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的一個(gè)基因。在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株中其異常表達(dá)miR-10b可促進(jìn)細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移，這部分是由于直接抑制同源蛋白HOXD10的表達(dá)而導(dǎo)致的。

3 miRNA在腫瘤診斷中的作用

迄今為止，已有多個(gè)研究證實(shí)miRNA在不同類型的腫瘤中表達(dá)不同，可應(yīng)用于腫瘤的診斷及分型。Lu Z等檢測了334個(gè)樣本中217種miRNA表達(dá)，樣本包括多種腫瘤組織及正常組織，發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中miRNA表達(dá)不同；通過miRNA表達(dá)特征可進(jìn)一步區(qū)分腫瘤的分子血亞型，如bcr-abl陽性樣本；另外，在組織學(xué)無法準(zhǔn)確診斷的17種惡性腫瘤中，通過miRNA篩選可區(qū)分該類腫瘤，較mRNA表達(dá)譜芯片更為準(zhǔn)確。

Ng E K等就血漿中95種miRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)行了比較系統(tǒng)地探討。研究者采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法分別檢測了結(jié)直腸癌患者和健康人血漿中的95種miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-92在結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)水平顯著增高，有趣的是，并沒有檢測到miR-92在晚期結(jié)直腸癌患者血漿中過度性表達(dá)，提示血漿miR-92可以作為早期結(jié)直腸癌的診斷性標(biāo)志物［16］。

miRNA的檢測常用的方法包括RNA印跡分析方法、miRNA基因芯片（microarray）和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等。RNA印跡分析方法是研究miRNA表達(dá)水平最可靠的技術(shù)，常用于檢測腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，但該技術(shù)有操作復(fù)雜、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。miRNA基因芯片技術(shù)是一種更理想的檢測miRNA的表達(dá)圖譜的方法，能同時(shí)檢測多個(gè)miRNA，但miRNA基因芯片技術(shù)只能分析已知的miRNA表達(dá)水平，不能分析未知的miRNA。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是實(shí)用價(jià)值很高的定性定量檢測技術(shù)，具有用時(shí)少、靈敏度高、精確度高、重復(fù)性好、可以高通量檢測、能有效區(qū)分miRNA前體分子以及其他成熟miRNA同源分子等優(yōu)點(diǎn)，已被越來越多地應(yīng)用于miRNA的檢測。

最近的研究取得了一定的進(jìn)展，我們了解到外周血中的miRNA很可能來源于機(jī)體多種組織及多種類型的細(xì)胞，包裝于外染色體（exosome）或經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾釋放入血，從而免受RNase的降解［17-20］。Valadi等表示某些mRNA、miRNA選擇性地包裝于外染色體，似乎mRNA、miRNA有著自己的“命運(yùn)”，這或許是不同來源的標(biāo)本（組織、血清、血漿、全血等）含有不同種類miRNA的原因之一。

對miRNA在腫瘤中的表達(dá)特征、miRNA靶基因的證實(shí)，miRNA抑癌、致癌機(jī)制及其表達(dá)失調(diào)機(jī)制的研究，對于腫瘤的臨床診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。miRNA將影響著腫瘤治療的新進(jìn)展已為期不遠(yuǎn)。

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