核酸擴(kuò)增新技術(shù)*

魯 雪,李 赟,黃 倢

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,山東青島 266003;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266071)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是體外擴(kuò)增 DNA序列的技術(shù),它的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。自1985年P(guān)CR技術(shù)建立以來[1],該技術(shù)不斷發(fā)展,逐漸成為分子生物學(xué)、基因組學(xué)、疾病診斷等領(lǐng)域的基本研究手段。PCR反應(yīng)過程包括變性、退火和延伸三個(gè)階段,因此PCR技術(shù)需要特殊的熱循環(huán)儀器,耗時(shí)長(2 h～3 h)。由于PCR技術(shù)靈敏度高,容易產(chǎn)生假陽性反應(yīng),并且,由于檢測形式單一,結(jié)果不易判讀[2]。因此,亟需更加有效的核酸擴(kuò)增方法來替代PCR技術(shù)。目前,在聚合酶鏈反應(yīng)這一基本原理的基礎(chǔ)上發(fā)展出來一系列新的核酸擴(kuò)增概念和實(shí)驗(yàn)方法,本文簡要介紹了幾種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamp lification,LAMP)是一種簡單、快速、特異性強(qiáng)、耗費(fèi)低的核酸擴(kuò)增技術(shù),可以在等溫條件下一步完成。LAM P技術(shù)的過程可以分為三個(gè)階段,即起始階段,循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸階段。由于原理比較復(fù)雜,可以通過網(wǎng)站上的動(dòng)畫了解其過程[3]。LAMP技術(shù)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),以及針對目的基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)的2條內(nèi)引物(FIP,BIP)和2條外引物(F3,B3)進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增[4]。這一擴(kuò)增反應(yīng)是恒溫進(jìn)行的鏈置換反應(yīng)。將樣品、引物、DNA聚合酶混合物在63℃溫育,基因的擴(kuò)增和檢測可以一步完成。與PCR技術(shù)和熒光定量 PCR技術(shù)相比,LAMP技術(shù)更加簡單、特異性和靈敏度更高。LAMP的高特異性和高靈敏度是基于恒溫條件下進(jìn)行的連續(xù)擴(kuò)增,其擴(kuò)增的高效性產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物和焦磷酸根離子,焦磷酸根離子與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合形成焦磷酸鎂白色沉淀。隨著DNA的不斷合成,焦磷酸鎂沉淀量不斷增加,反應(yīng)混合物的混濁度也不斷增大。根據(jù)這一關(guān)系,實(shí)時(shí)測量反應(yīng)混和物的混濁度可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測LAMP反應(yīng)的進(jìn)程[5]。

作為一種恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng),LAMP技術(shù)不需要熱循環(huán),因此使用簡單的金屬浴或者水浴就可以進(jìn)行反應(yīng),同時(shí),LAMP技術(shù)不需要特別的試劑。由于對設(shè)備和試劑的要求低,LAMP技術(shù)的成本也比較低。在LAMP反應(yīng)中,擴(kuò)增和監(jiān)測同時(shí)在指數(shù)生長期完成,而不是平臺期,因此可以避免平臺期出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)而造成的低靈敏度[6]。此外,只有當(dāng)靶基因的6個(gè)區(qū)域全部被引物準(zhǔn)確識別時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)才能進(jìn)行,因此LAMP技術(shù)具有很高的特異性。加入反轉(zhuǎn)錄酶還可以直接從RNA擴(kuò)增DNA(RTLAMP)[7]。

LAM P技術(shù)原理雖然復(fù)雜,但是實(shí)際操作過程卻十分簡單,是一種簡單、快速、有效的核酸擴(kuò)增技術(shù)。黃倢,張慶利等[8-9]近年來,研發(fā)出對蝦白斑綜合征病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒,以及大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。LAMP技術(shù)診斷試劑盒的研發(fā),將會給研究人員帶來更大的便利,市場前景將十分廣闊。

2 賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)

賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(helicase-dependent isothermal DNA am plification,HDA)是美國 New England Biolabs的研究人員近年來研究出來的一種新型體外恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)[10]。該技術(shù)在恒溫(62℃～65℃)下進(jìn)行,依賴解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶。其基本原理是:首先,解旋酶打開DNA雙鏈,形成單鏈DNA;其次,單鏈結(jié)合蛋白(SSB)與之結(jié)合,保持單鏈 DNA穩(wěn)定性;接下來,在DNA聚合酶的作用下催化生成新的雙鏈DNA,新生成的雙鏈DNA成為下一輪擴(kuò)增的模板,如此重復(fù),DNA的量呈指數(shù)增加。

目前常用的解旋酶是大腸埃希菌 UvrD解旋酶[10-11],還有一種解旋酶是T7噬菌體基因4編碼蛋白,與大腸埃希菌UvrD解旋酶相比較,其解鏈速度更快,擴(kuò)增長度更長[12-13];常用的單鏈結(jié)合蛋白(SSB)有T4噬菌體基因32編碼蛋白,以及RB49噬菌體基因32編碼蛋白[10];常用的DNA聚合酶則選擇Bst酶,或者 K lenow Fragment聚合酶[10,14]。

HDA技術(shù)與其他恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)相比,優(yōu)勢在于其DNA循環(huán)復(fù)制體系。由于其解旋酶不需要熱變性就可以打開DNA雙鏈,使得HDA技術(shù)的反應(yīng)程序十分簡單,恒溫條件下就可以完成,這一優(yōu)勢使其成為核酸體外擴(kuò)增的有利手段[12]。

3 固相PCR技術(shù)

固相PCR(solid phase PCR)技術(shù)是在固體表面進(jìn)行的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是將引物通過各種共價(jià)鍵結(jié)合到固相基質(zhì)上,使擴(kuò)增反應(yīng)在固相基質(zhì)表面進(jìn)行。自Adessi C等[15]于2000年發(fā)明了這種技術(shù)以來,許多研究者對這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,以期其能夠替代常規(guī)PCR技術(shù)。固相支持物有瓊脂糖小珠,聚丙烯酰胺小珠、乳膠小珠、磁珠、硅片、玻片以及尼龍膜等[16]。固定引物有許多種不同的化學(xué)方法,其中,引物5′末端修飾巰基后,通過偶聯(lián)劑將其共價(jià)結(jié)合到氨基硅烷化玻片上的效果最好[15]。

固相PCR技術(shù)可以解決多重PCR技術(shù)難以克服的問題:當(dāng)許多不同的引物對作為反應(yīng)物同時(shí)出現(xiàn)在同一PCR體系中,引物之間、引物和模板之間容易產(chǎn)生錯(cuò)配,因而降低了反應(yīng)的特異性。固相PCR技術(shù)將引物固定在固相支持物表面,可以在空間上阻止引物彼此接觸而形成的二聚體。但是,這一技術(shù)同樣會導(dǎo)致反應(yīng)效率降低,以及支持物表面反應(yīng)物的損失。M euzelaar L S等[17]于2007年發(fā)明了MegaPlex PCR技術(shù),這一技術(shù)首先將擴(kuò)增基因的特異引物固定到磁珠上,反應(yīng)起始階段,特異引物起作用,在固相支持物表面擴(kuò)增出一定拷貝的模板,隨后引入一種通用引物,替代特異引物,該通用引物在反應(yīng)液中繼續(xù)擴(kuò)增,這樣可以充分提高反應(yīng)效率。MegaPlex PCR是一種創(chuàng)新的固相PCR技術(shù),可以很好地實(shí)現(xiàn)高通量的多重PCR。

4 指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)

指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世紀(jì)90年代初由Tuerk C和Gold L發(fā)明的一種新型組織化學(xué)技術(shù)[18]。其基本原理是:首先在體外合成一個(gè)大量的隨機(jī)寡核苷酸庫(SSR),每條寡核苷酸由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列構(gòu)成,隨機(jī)序列長度在20個(gè)～40個(gè)堿基之間。將靶分子與該隨機(jī)寡核苷酸庫混合,靶分子會與寡核苷酸(RNA或 ssDNA)“適配子”結(jié)合形成復(fù)合物,再將該復(fù)合物分離,洗脫下寡核苷酸,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,來制備下一輪的寡核苷酸文庫。經(jīng)過結(jié)合-分離-洗脫-加倍這一過程的反復(fù)篩選,與靶分子親和力高的“適配子”便從隨機(jī)寡核苷酸庫中分離出來,并且其純度也不斷增高,最終可以占據(jù)庫的90%以上[18]。

通常隨機(jī)寡核苷酸庫的容量是1014～1015個(gè)寡核苷酸序列。由于寡核苷酸“適配子”能夠形成多種三維構(gòu)象,它們幾乎可以與自然界所有種類的分子結(jié)合[19],從大分子如氨基酸多肽、核酸、復(fù)雜藥物高分子,到有機(jī)小分子,甚至是金屬離子,這些“適配子”對它們都具有很高的親和力,因此“適配子”被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、體外診斷和體內(nèi)治療[20]。由于寡核苷酸“適配子”只識別那些具有與之互補(bǔ)空間結(jié)構(gòu)的分子,因此其識別特異性非常高。根據(jù)Jenison等研究發(fā)現(xiàn),用茶堿篩選得到的RNA“適配子”對茶堿的親和力是對咖啡因的10 000倍,盡管咖啡因與茶堿的空間結(jié)構(gòu)相差很小,只有一個(gè)甲基[21]。氨基酸、核苷酸的寡核苷酸“適配子”能將其與鏡像體、突變體區(qū)別開來。同時(shí),“適配子”也具有高親和力的特點(diǎn)。這種“適配子”與蛋白質(zhì)靶分子作用的解離常數(shù)可達(dá)nmol/L甚至pm ol/L的水平,與小分子靶物質(zhì)作用的解離常數(shù)也可以達(dá)到μmol/L～nmol/L的水平,有的“適配子”親和力甚至高于天然配體[22]。目前,SELEX技術(shù)已經(jīng)得到不斷完善,通過各種手段對“適配子”進(jìn)行修飾,進(jìn)一步提高了其親和力和穩(wěn)定性,加之操作過程的自動(dòng)化,大大增加了SELEX技術(shù)的效率。

5 SOLEXA高通量測序技術(shù)

Solexa高通量測序技術(shù)是由劍橋大學(xué)的Solexa公司創(chuàng)立[23],該技術(shù)運(yùn)用獨(dú)特的邊合成邊測序技術(shù)(sequencing-by-synthesis)和可逆中止化合物染料技術(shù)(reversible terminator chemistry),提供高通量、低成本的基因組測序。是“下一代”測序技術(shù)[24],也稱“深度”測序技術(shù)[25]的代表之一。

Solexa技術(shù)的原理是首先把基因組DNA從細(xì)胞中提取出來,然后將其打斷成100 bp～200 bp大小的片段,在每個(gè)片段末端都加上接頭(adapter),再經(jīng)過PCR擴(kuò)增制成DNA簇,將DNA簇加入到帶有接頭的芯片上,通過接頭綁定在芯片上,之后加入四種熒光染料標(biāo)記的核苷和聚合酶,應(yīng)用邊合成邊測序的原理,互補(bǔ)的核苷與核苷酸片段的第一個(gè)堿基配對,通過聚合酶結(jié)合到引物上,多余的核苷被移走,單鏈DNA分子通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行延伸,最后,利用生物發(fā)光蛋白檢測每個(gè)加入到DNA片段上堿基的信號,便可對基因組DNA進(jìn)行測序[25]。

用于DNA測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法[26]以及M axam和 Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法[27]。當(dāng)前普遍使用的測序儀,一次只能讀取1 000個(gè)左右的堿基。Solexa技術(shù)可在每一張芯片獲取1 G的堿基數(shù)據(jù),速度比傳統(tǒng)的Sanger測序要快上百倍。除了大大降低成本,Solexa技術(shù)還不受物種限制,對人類、動(dòng)植物、微生物DNA都可以進(jìn)行測序。同時(shí)可以檢測到單拷貝分子的變化,用于SNP分析。Solexa測序技術(shù)在對基因組進(jìn)行測序的同時(shí),也可以對基因表達(dá)調(diào)控,核酸蛋白互作,以及基因功能等進(jìn)行研究。

6 結(jié)語

本文介紹的幾種核酸擴(kuò)增新技術(shù)中,LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵,同時(shí)利用鏈置換活性的Bst酶進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增;HDA技術(shù)依賴解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和聚合酶這3種酶的共同作用,因此對酶的要求非常高;LAM P技術(shù)和HDA技術(shù)均是恒溫條件下的核酸擴(kuò)增,HDA技術(shù)甚至不需要熱變性,二者已經(jīng)脫離了PCR的概念。固相PCR技術(shù)是改良的PCR技術(shù),通過化學(xué)或者生物學(xué)手段將引物固定在固相基質(zhì)上,以避免引物間相互干擾,更便于產(chǎn)物的分離和純化;SELEX技術(shù)利用PCR技術(shù)與寡核苷酸隨機(jī)文庫的結(jié)合,來進(jìn)行特異序列的篩選;SOLEXA技術(shù)是PCR應(yīng)用的新概念,用于基因組文庫的高通量測序,是固相PCR應(yīng)用的平臺。

這些核酸擴(kuò)增的新技術(shù)有著重要的應(yīng)用價(jià)值,和各自無法比擬的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)得到快速的推廣和應(yīng)用,隨著研究者們對這些技術(shù)不斷的完善,其操作過程將更加簡單和規(guī)范,其效率也將進(jìn)一步提高。這些核酸擴(kuò)增的新技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域,是必然趨勢,發(fā)展前景十分廣闊。

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