微生物物證檢驗(yàn)進(jìn)展

張幼芳浙江警察學(xué)院，浙江杭州 310053

進(jìn)入21世紀(jì)后，法庭科學(xué)中一個(gè)新的專(zhuān)業(yè)——微生物物證檢驗(yàn)逐漸興起，這一方面是由于社會(huì)發(fā)展存在的問(wèn)題，將微生物作為武器進(jìn)行恐怖襲擊和犯罪的案例時(shí)有發(fā)生；另一方面，也因?yàn)樯锟茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物物證檢驗(yàn)技術(shù)得到了不斷發(fā)展。

微生物物證主要為細(xì)菌、病毒、真菌等可能涉及犯罪的微生物。物證檢材可以是生物制劑的原始物品，被微生物制劑污染的物品，盛放微生物制劑的容器，被微生物感染的人或動(dòng)物樣本，攜帶有現(xiàn)場(chǎng)微生物的物品等。

1 微生物物證的種類(lèi)

1.1 微生物作為生物恐怖武器

生物恐怖是造成社會(huì)恐怖的最嚴(yán)重的犯罪形式之一。美國(guó)“9 ·11”之后出現(xiàn)的炭疽桿菌信件攻擊事件，讓我們看到生物恐怖襲擊已經(jīng)從可能變成為現(xiàn)實(shí)。該類(lèi)微生物物證常為微生物制劑原始物品，通過(guò)郵件或其他方式轉(zhuǎn)移到被害人，常見(jiàn)檢材為被微生物制劑污染的物品，盛放微生物制劑的容器，通過(guò)檢測(cè)，可確定是否為生物恐怖活動(dòng)，為何種致病微生物，從而為打擊犯罪，采取相應(yīng)的保護(hù)預(yù)防措施提供依據(jù)。

1.2 微生物作為生物犯罪手段

生物犯罪是指故意使用致病微生物導(dǎo)致人、動(dòng)物和植物發(fā)病，威脅人類(lèi)健康，破壞農(nóng)畜牧業(yè)發(fā)展和食品安全的犯罪行為[1]。如艾滋病人故意傳播艾滋病毒，導(dǎo)致他人患病[2]。常用檢材為被微生物感染的人或動(dòng)植物樣本，通過(guò)檢測(cè)，確定微生物的來(lái)源，從而認(rèn)定犯罪。

在有些案件中，涉嫌病人在醫(yī)院內(nèi)的感染，為確定醫(yī)院是否負(fù)有責(zé)任，也需對(duì)微生物的來(lái)源進(jìn)行認(rèn)定。

1.3 微生物作為犯罪的見(jiàn)證者

微生物物證可在案犯實(shí)施犯罪過(guò)程中發(fā)生轉(zhuǎn)移，如發(fā)生在野外的案件，嫌疑人常在不經(jīng)意間將現(xiàn)場(chǎng)的泥土黏附在鞋子、衣服上攜帶走，通過(guò)檢測(cè)泥土中的微生物，將其與現(xiàn)場(chǎng)泥土比對(duì)，可將嫌疑人與犯罪聯(lián)系起來(lái)。

2 微生物物證的檢驗(yàn)

微生物物證檢驗(yàn)的檢測(cè)技術(shù)主要有物理分析技術(shù)、免疫學(xué)分析技術(shù)、化學(xué)分析技術(shù)和DNA分析技術(shù)，其中，DNA分析技術(shù)是微生物物證檢驗(yàn)最有力的方法，不僅可以準(zhǔn)確檢測(cè)微生物種類(lèi)，還可能鑒別菌毒株或亞株；同時(shí)，DNA作為法庭證據(jù)，也容易被人們接受。

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)應(yīng)用之前，用于微生物檢驗(yàn)的DNA分析技術(shù)僅局限于雜交技術(shù)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分型，這些方法所需檢材量大，耗時(shí)、費(fèi)力，不易自動(dòng)化操作。對(duì)特定序列的擴(kuò)增手段為微生物檢測(cè)提供了寬廣的技術(shù)基礎(chǔ)。

2.1 核糖體基因分析

細(xì)菌中有3種核糖體RNA，分別為5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA， rRNA基因有保守區(qū)和可變區(qū)，16S rRNA的對(duì)應(yīng)基因?yàn)?6S rDNA，在3種核糖體RNA中，5S rRNA因核苷酸太少，沒(méi)有足夠的遺傳信息用于分類(lèi)，23S rRNA含有的核苷酸約為16S rRNA的兩倍，分析比較困難，16S rRNA所含核苷酸適中，又具有保守型和存在普遍性，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，檢測(cè)技術(shù)流程為，先將細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取基因組DNA，然后根據(jù)已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳分離回收擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與核糖體基因數(shù)據(jù)庫(kù)（現(xiàn)在已有數(shù)千種微生物16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)）進(jìn)行比對(duì)，確定該未知菌的種屬。

不幸的是，在病毒中沒(méi)有可用于區(qū)分種屬的共同的基因。但是在真菌中，核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)包括5S、5.8S、18S和28SrDNA，18S、5. 8S、28S rDNA基因序列進(jìn)化緩慢而相對(duì)保守，但這3個(gè)基因序列之間的ITS序列的進(jìn)化則相當(dāng)迅速，因而其序列廣泛用于真菌各級(jí)水平的系統(tǒng)學(xué)研究[3]。

2.2 多位點(diǎn)序列分析（M LST）

僅僅根據(jù)一個(gè)或2個(gè)DNA區(qū)域鑒定微生物種類(lèi)往往分辨率不夠，而且有些微生物種類(lèi)的rRNA基因序列相同或者非常接近，為了提高微生物種類(lèi)鑒別率，另外一些保守或共同的基因組區(qū)域可用于檢測(cè)，多位點(diǎn)序列分析（MLST）檢測(cè)5～7個(gè)管家基因間450bp～500bp片段，大多數(shù)的細(xì)菌種類(lèi)可通過(guò)MLST鑒別。

2.3 多位點(diǎn)VNTR分析（MLVA）

與真核生物一樣，細(xì)菌基因組DNA中也存在重復(fù)序列，許多細(xì)菌可通過(guò)檢測(cè)這些VNTR區(qū)域進(jìn)行鑒別，如美國(guó)2001年炭疽信件攻擊事件中的炭疽孢子用多位點(diǎn)VNTR分析（MLVA），鑒定為艾姆斯張力菌株，該類(lèi)菌株屬美國(guó)軍方實(shí)驗(yàn)室使用。

MLVA根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分型，擴(kuò)增片段直接與DNA片段重復(fù)次數(shù)相關(guān)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)電泳分型，現(xiàn)在一般采用毛細(xì)管電泳，自動(dòng)化程度高。MLVA的局限性在于，因?yàn)樵摲z測(cè)的是突變率較高的部位，因此，不適合于進(jìn)化關(guān)系研究。

2.4 單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

另一種用于微生物種屬鑒別的方法為單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析法，現(xiàn)在一般用美國(guó)ABI公司的ABI PRISM SNaPshot? 試劑盒，用這種試劑盒檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性好、可自動(dòng)化操作，電泳分型和熒光檢測(cè)所需技術(shù)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都能完成。

雖然DNA檢驗(yàn)在微生物鑒別方面已取得一定成果，但其分辨效率仍遠(yuǎn)低于其他傳統(tǒng)物證檢驗(yàn)，距偵查破案的實(shí)際需求仍有一定距離，還需要不斷地進(jìn)行研究。一方面，應(yīng)建立新的更加快速的檢測(cè)微生物多態(tài)性的方法；另一方面，要做好基礎(chǔ)工作，建立完備的微生物DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。

[1]R Breeze, B Budowle and S Schutzer. Microbial Forensics[M].Bur l ington: ElseVier Academic Press，2005.