糖尿病大鼠腎臟腎素及其受體表達改變*

高 召，任志龍，丁國華，梁 偉，楊紅霞(武漢大學人民醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430060)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在糖尿病腎病進展過程中發(fā)揮著關鍵的作用，阻斷RAS成為目前治療糖尿病腎病的重要措施[1-3]。然而臨床上作用于RAS的藥物會引起血漿腎素水平升高，減弱治療效果[4]。近年來腎素及腎素受體成為研究的熱點，人們希望通過此靶點從源頭阻斷RAS以獲得更佳療效。目前，有關糖尿病模型腎臟中腎素和腎素受體表達水平的研究較少。為了進一步研究糖尿病模型腎素與腎素受體表達變化與糖尿病腎病之間的聯(lián)系，本研究擬通過建立鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠腎臟腎素及腎素受體表達變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 STZ(Sigma);多克隆兔抗大鼠腎素/腎素抗體(renin/renin receptor antibody，Santa Cruz公司);SP免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋坊上海生物科技有限公司);PCR試劑盒(Fermentas)、renin/renin receptor引物和β-actin引物(上海英駿);DNA M arker(SABC公司);BCA試劑盒(Pierce);125I血管緊張素Ⅰ放射免疫分析試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司);紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司);BX51顯微攝像系統(tǒng)(Olympus);PCR儀(T-personal，Biometra);ZF-258全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 12只體質(zhì)量180～220 g的SPF級雄性Wistar大鼠(湖北省預防醫(yī)學科學院實驗動物中心)，隨機分為正常對照組(N組)6只和模型組(DM組)6只。DM組禁食36 h后在大鼠左下腹腔注射STZ 60 mg/kg。N組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。DM組于72 h后尾靜脈取血測定血糖，以血糖大于或等于16.7 mmol/L，確定為糖尿病大鼠。未達標準者，重復上述方法、劑量，至模型成功[5]。實驗期間兩組均自由飲食。

1.3 標本采集與檢測 造模成功后第 4周、8周收集24 h尿液檢測尿總蛋白和尿肌酐;8周后乙醚麻醉動物，心臟采血，檢測血糖、血肌酐(SCr)、血鈉(Na)、血鉀(K)。腎臟常規(guī)石蠟包埋，切片，用于PAS染色及免疫組化。血糖、肌酐、血鈉(Na)、血鉀(K)由Beckman自動生化分析儀進行檢測。免疫透射比濁法檢測尿蛋白(上海太陽生物技術有限公司)。

1.4 腎組織病理學分析 腎組織石蠟切片(2～3μ m)常規(guī)脫蠟入水，行PAS染色，普通光鏡下觀察腎組織病理改變[6]。腎小球損傷程度采用腎小球損傷指數(shù)進行半定量分析，評分標準如下:病變范圍未見明顯改變計0分，病變范圍占腎小球面積小于25%計1分，25%～50%之間計2分，50%～75%之間計3分，大于75%計4分。每張切片200倍鏡下觀察50個正切腎小球，腎小球損傷指數(shù)計算公式為:1×N1+2×N2+3×N3+4×N4，式中N1代表1分的損害腎小球個數(shù)，…，N4為代表4分的損害腎小球個數(shù)。

1.5 免疫組化法檢測腎素及腎素受體表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波修復，3%H2O2阻斷，5%BSA封閉，加一抗(兔腎素和腎素受體多克隆抗體，santa cruz公司)4℃過夜，滴加二抗IgG及SP復合物，DAB顯色，蘇木素復染鹽酸分化，脫水，封片。以PBS代替一抗設置陰性對照，以細胞漿棕黃色為陽性表達。每張切片400倍鏡下隨機攝取20個腎小球，采用Image-pro plus6.0軟件分析，以腎小球切面腎素和腎素受體積分光密度(IOD)表示陽性物質(zhì)的相對含量。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測腎素/腎素受體mRNA表達 取100 mg腎組織加入T rizol試劑1 mL，參照說明書提取總RNA。2μg RNA在 20μ L逆轉(zhuǎn)錄體系中擴增合成cDNA。模板進行腎素及腎素受體PCR擴增反應，用Primer5.0軟件設計引物。腎素上游引物:5′GAG TCA TCC CTG TCT TCG 3′;下游引物:5′GTG TCC ACC ACT GCC ATA 3′。產(chǎn)物為256 bp。腎素受體上游引物:5′GGG AAG CGT TAT GGAG 3′;下游引物:5′CGC AAG GTT GTA GGGA 3′。產(chǎn)物為219 bp。用β-actin作為內(nèi)參，其上游引物為:5′AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC 3′;下游引物為:5′TCT CAG CTG TGG TGG TGA AG 3′，產(chǎn)物為 220 bp。PCR反應體系 25μ L:cDNA 1μ L，上下游引物1μ L，2 ×PCR mix 12.5μ L，去核酸水9.5μ L。擴增條件為:預變性94 ℃3 min，變性94℃45 s，退火溫度:腎素54.1℃45 s、腎素受體50.1℃45 s，延伸72℃45 s，循環(huán)35次，72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，ZF-258全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行攝影并采用Gel-pro Analyzer version 4.5行半定量分析。用renin/renin receptor與β-actin比值表示 renin/renin receptor的mRNA表達水平。

1.7 放射免疫法檢測腎臟腎素活性 PBS緩沖液中加入1μg/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制劑，100 mg腎組織加1 mL緩沖液，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液在4℃下2000 r/min離心20 min，取上清液用放射免疫法檢測血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)的含量。腎素活性是以AngⅠ的產(chǎn)生速率來衡量[7]。同時用BCA法檢測上清液總蛋白含量，放射免疫法測量值與總蛋白含量值相比得出含量百分比。具體方法參照試劑盒說明書。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠生化指標檢測 DM組大鼠血糖明顯高于N組。DM組4周始尿蛋白較N組升高，8周時DM組24 h尿蛋白高于N組。DM組SCr較N組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。DM組腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值與N組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組間 SCr和血鈉、血鉀水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.2 大鼠腎臟病理改變 DM組PAS染色可見節(jié)段性的系膜基質(zhì)和系膜細胞的增生，DM組腎小球損傷指數(shù)顯著高于N組，見彩插Ⅰ圖1。

2.3 腎臟腎素和腎素受體表達改變 腎素主要分布于腎小管，以腎小球周圍近曲小管為主;腎素受體在腎臟表達廣泛，在腎小球系膜細胞、足細胞、近端小管、遠端小管均有表達，見彩插Ⅰ圖2、3。

2.4 腎素及腎素受體mRNA表達 DM組腎素mRNA較N組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，腎素受體 mRNA與N組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖 4、圖5。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白量(24 h)和SCr的比較

表2 各組大鼠腎腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、生化指標的比較

圖1 兩組腎小球病理變化(PAS×400)

圖2 兩組腎素表達光密度值(IHC×400)

圖3 兩組腎臟腎素受體表達光密度值(IHC×400)

圖4 兩組腎臟腎素mRNA表達

圖5 兩組腎臟腎素受體(RnR)mRNA表達

2.5 腎臟腎素活性變化 DM組AngⅠ的含量較N組明顯升高[(5.14±1.05)×10-6比(2.12±0.58)×10-6，P＜0.05]。

3 討 論

本實驗觀察到腎素在腎小球周圍區(qū)域如腎小管高表達，腎小球表達較弱。這可能與腎小球旁器是腎素的主要來源有關。以往認為腎素原不過是腎素的前體，沒有生物學作用，而不被重視，腎素受體的發(fā)現(xiàn)改變了人們的認識。2002年腎素受體被發(fā)現(xiàn)，它能夠增加腎素和腎素原的活性并誘導自身活化[8]。腎素/腎素原結合腎素受體激發(fā)2條通路:腎素原能夠催化血管緊張素產(chǎn)生激活傳統(tǒng)的 RAS，同時還能激活細胞內(nèi)絲裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，M APK)通路，上調(diào)促纖維化基因表達誘導腎小球硬化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)腎素受體在腎內(nèi)廣泛表達，腎小球的系膜細胞、足細胞、近端小管、遠端小管均有表達。這預示著腎素受體在機體的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。糖尿病大鼠腎臟病進展與腎組織RAS激活有關，研究腎素受體在該系統(tǒng)的地位具有重要意義。目前，已有阻斷腎小球系膜細胞腎素受體可以延緩細胞外基質(zhì)蓄積的報道[10]。

已有研究表明糖尿病狀態(tài)下腎內(nèi) RAS激活[11]，局部RAS激活被認為與糖尿病腎病腎功能惡化有關[12]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組腎素水平升高，放射免疫法證實糖尿病模型組腎臟腎素活性升高，Takahashi等[13]用實時定量PCR檢測17和29周糖尿病大鼠腎臟腎素受體表達變化，發(fā)現(xiàn)正常對照與糖尿病模型組腎素受體表達差異無統(tǒng)計學意義，本研究模型組腎素受體表達變化與Takahashi等人研究一致。Schefe等[14]認為腎素表達增加可通過短負反饋機制抑制腎素受體表達，即高腎素水平會抑制腎素受體的表達，防止腎素受體過度激活。Siragy和Huang[15]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎素受體表達增加，并提出該效應可能是通過增強血管緊張素受體-1(AT1)-NADPH氧化酶活性，上調(diào)腎素受體表達。與本研究不同的是Siragy檢測的是6周糖尿病大鼠腎素受體表達情況，目前有關腎素受體的調(diào)節(jié)機制還不清楚，有待探討。盡管在本研究中兩組間腎素受體表達沒有差異，但是腎素活性增高可以通過激活RAS途徑，造成腎臟損害，在本實驗中觀察到糖尿病大鼠腎小球系膜細胞增生，系膜區(qū)基質(zhì)沉積，同時產(chǎn)生大量蛋白尿。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，腎素在腎小球周圍區(qū)域高表達，腎小球表達較弱。腎素受體在腎小球系膜細胞、足細胞、近端小管、遠端小管均有表達。糖尿病大鼠腎臟腎素表達增加，可能與腎臟損傷有關，但腎素受體表達無改變，其分子機制有待進一步研究。

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