蘋果酸舒尼替尼對人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的增殖抑制作用

盧康榮，周 婭，杜 瑋，王萬山

(1.南方醫(yī)科大學(xué)教育部/廣東省共建“重大疾病的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室”，廣州 510515;2.廣州軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部 510063;3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 510010;4.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510515)

蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate，S U11248)是一種高選擇性多靶點小分子蛋白激酶抑制劑，2006年獲得美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，主要用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(RCC)和不能耐受或伊馬替尼治療失敗的轉(zhuǎn)移性胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)。Sunitinib能抑制多種信號通路，同時具有抗血管生成和抗腫瘤增殖的活性。對血小板衍生生長因子受體(PDGFR)α、β，血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)1、2、3，干細(xì)胞生長因子受體(c-kitR)，F(xiàn)MS酪氨酸激酶-3(Flt-3)，集落刺激因子受體1(CSF-1R)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(RET)等多種受體酪氨酸激酶均有抑制作用。

以往研究顯示，Sunitinib具有廣譜的抗腫瘤活性，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌模型中，Sunitinib有抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用[1-3]。本實驗將Sunitinib作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo，利用四亞基噻唑藍(lán)(M TT)法和臺盼藍(lán)拒染法檢測其生長抑制作用，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，以此探討Sunitinib對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌Lo Vo細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤科提供，常規(guī)培養(yǎng)于 RPMI-1640完全培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃、50 m L/L CO2的濕化環(huán)境中培養(yǎng)。Sunitinib購自輝瑞公司。MT T、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。胰蛋白酶購自美國Amresco公司，胎牛血清購自GIBCO公司。順鉑(C-DDP，20 mg/支)購自錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，其他常用化學(xué)試劑購自廣州化學(xué)試劑廠。酶標(biāo)儀(STA T FAX-2100)購自廣州倍威儀器有限公司，另外還有透射電子顯微鏡HITACHI H-7500、流式細(xì)胞儀BD FACSAria等。

1.2 M TT法測定細(xì)胞抑制率 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用25 g/L的胰酶消化后，離心后計數(shù)，用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成5×104個/m L的細(xì)胞懸液，接種在 96孔板中，每孔接種 200μL，每組設(shè) 6個復(fù)孔，置于37℃、50 m L/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁，再按要求加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μL含 20 mmol M TT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)孔中的液體，每孔加入150μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩10 min。然后在酶標(biāo)儀上以570 nm的波長測定光密度值A(chǔ)值。結(jié)果判定:細(xì)胞生長抑制率=[(空白對照組孔平均A值-實驗組孔平均A值)/空白對照組孔平均A值]×100%。將Sunitinib的濃度分別設(shè)為1.25、2.5、5、10、20 μM ，實驗設(shè)立陽性和陰性對照組。

1.3 臺盼藍(lán)拒染法測定生長曲線 將細(xì)胞用100 m L/L胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基配成100×104個/m L的細(xì)胞懸液，然后接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔200μL，實驗組加入不同濃度的受試藥物，空白對照組加入等體積的溶劑，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃、50 m L/L的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照空白對照組和實驗組給予處理。然后予 0、1、2、3、4、5、6 d各取樣40μL，加入 4 m L/L 臺盼藍(lán)液 10 μL，計數(shù)細(xì)胞數(shù)。每孔計數(shù)3次，取均值，再累計5孔均值，根據(jù)細(xì)胞濃度值的對數(shù)值與時間作用繪圖，即為細(xì)胞生長曲線，實驗重復(fù)3次。陽性對照組設(shè)為順鉑 10μg/m L。

1.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期 實驗分為實驗組(2.5、5、10、20 μM)和陰性對照組(加入等量的生理鹽水)。以5×104個/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板上，待細(xì)胞增殖至80%融合時給予藥物刺激。作用24 h后用胰酶消化細(xì)胞，2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用 D-Hanks′液清洗2次，離心，70%乙醇4℃固定。將固定的細(xì)胞以4000 r/min離心5 min，用D-Hanks′液清洗 1～2次，沉淀物懸浮于 0.5 m L的PI和5μL的RNase酶中，避光放置染色30 min，200目篩網(wǎng)過濾。用流式細(xì)胞儀作DNA周期分析。

1.5 透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) 以5×104個/mL的細(xì)胞密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞增殖至80%融合時，加入實驗藥物，使其終濃度為10μM ，作用24 h后，消化，收集細(xì)胞，用D-Hanks′液漂洗，1200 r/min離心 10 min，細(xì)胞團塊用2.5%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸固定 1 h，常規(guī)梯度脫水，醋酸鈾染色，EPON 812包埋，超薄切片，經(jīng)檸檬酸鉛染色后封片，透射電鏡下觀察、照相。

2 結(jié) 果

2.1 Sunitinib對Lo Vo細(xì)胞抑制作用的觀察 濃度為1.25、2.5、5、10、20μM 的Sunitinib作用于腫瘤細(xì)胞后的M TT結(jié)果顯示:該藥對Lo Vo細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，在10μM 濃度處細(xì)胞抑制率已經(jīng)達(dá)到65.81%，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 r=0.694(P＜0.004)。20μM 的抑制率反而不高，可能與藥物濃度過大有關(guān)(表1)。

2.2 Sunitinib對LoVo細(xì)胞抑制作用的時間效應(yīng)關(guān)系觀察生長曲線顯示，Sunitinib的各個濃度對腫瘤細(xì)胞生長均有抑制作用，其中以24 h的抑制作用最為明顯。尤其在10～20μM濃度范圍內(nèi)抑制作用較為明顯(圖1)。

2.3 流式細(xì)胞儀觀察 用不同濃度的Sunitinib處理24 h后，Lo Vo細(xì)胞周期各個時相分布也相應(yīng)發(fā)生改變，處于G0/G1期的細(xì)胞比例隨著 Sunitinib作用濃度的升高而增加，當(dāng)Sunitinib的濃度為10μM時，G0/G1期細(xì)胞達(dá)63.6%，而陰性對照組(未加 Sunitinib處理組)24 h后G0/G1期細(xì)胞僅為46.8%，與用藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);S期細(xì)胞的比例則隨Sunitinib作用濃度的增加呈現(xiàn)遞減趨勢。表明Sunitinib使LoVo細(xì)胞阻滯在G0/G1期(表2)。

表1 Sunitinib對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長的抑制作用(，%)

表1 Sunitinib對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長的抑制作用(，%)

Sunitinib濃度(μg/m L)IR C-DDP Sunitinib 1.25 0 16.19±0.1242.5 20.34±0.027 23.81±0.219558.65±0.014 41.06±0.14910 67.04±0.048 65.81±0.24620 53.13±0.034 58.68±0.028

圖1 Sunitinib對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞作用的生長曲線

表2 不同濃度的Sunitinib對LoVo細(xì)胞周期的影響(，%，n=6)

表2 不同濃度的Sunitinib對LoVo細(xì)胞周期的影響(，%，n=6)

與空白對照組比較，*:P＜0.01。

組別 細(xì)胞凋亡率細(xì)胞周期G0/G1 S G2/M空白對照組 0 46.8±1.32 49.7±0.21 2.41±0.28 Sunitinib濃度(μg/mL)1.25 14.3±0.58*62.7±5.54* 9.1±4.34* 8.4±5.12*2.5 16.7±0.69*61.5±5.56* 8.4±3.67* 8.2±7.981*519.0±0.73*63.2±5.42* 7.5±5.12* 8.1±6.98*10 21.3±0.83* 63.6±6.21* 7.4±4.67* 5.7±6.54*20 25.6±0.74* 65.5±6.28* 7.9±4.32* 8.1±5.21*

圖2 10μM Sunitinib作用于 Lo Vo細(xì)胞24 h后的電鏡圖像

2.4 透射電子顯微鏡觀察 10μM Sunitinib作用于LoVo細(xì)胞24 h后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，體積縮小，胞膜完整但發(fā)生皺縮，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)向核膜邊緣凝聚、固縮、邊聚(圖2)。

3 討 論

受體酪氨酸激酶(RTK)屬于Ⅲ和Ⅴ類裂解激酶域家族成員，它們的功能異常與多種實體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。RTKs由細(xì)胞外的配體結(jié)合域和細(xì)胞內(nèi)的催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。RTK受體與配體結(jié)合后，受體寡聚化，并且自磷酸化而激活下游信號通路。該信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)最終促使細(xì)胞存活和增殖，如腫瘤細(xì)胞通過分泌VEGF和PDGF直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進血管新生，使腫瘤生長、增殖和轉(zhuǎn)移。Sunitinib能抑制體內(nèi)多種受體RTK的磷酸化作用，特別是對與腫 瘤相關(guān) 的受 體 RTK、PDGFR、RET、KIT 等，以 及PDGFRβ-和 VEGFR2-依賴的腫瘤血管生長因子顯示很強的抑制作用，對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移顯示抑制作用[3-4]。2006年1月FDA批準(zhǔn)舒尼替尼用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和不能耐受或伊馬替尼(甲磺酸伊馬替尼、imatinib mesylateG、Gleevec)治療失敗的胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)患者。實驗顯示，在放、化療同時加用舒尼替尼有助于增強放、化療的抗腫瘤效應(yīng)[5]。

本實驗應(yīng)用Sunitinib作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞，觀察其對Lo-Vo細(xì)胞的生長抑制作用。實驗結(jié)果顯示在1.25～20μM的濃度范圍內(nèi)對LoVo細(xì)胞有不同程度的抑制作用，體外實驗藥物作用濃度范圍對臨床用藥選擇最佳給藥濃度具有借鑒意義。細(xì)胞生長曲線除了顯示Sunitinib有較明顯的生長抑制作用外，還較直接地反映了其對腫瘤細(xì)胞生長抑制的動態(tài)變化情況。細(xì)胞凋亡是一個細(xì)胞主動參與的復(fù)雜的病理生理過程，近年來的研究表明，許多抗腫瘤藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能是抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的機制之一?；熕幬镏饕峭ㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療目的，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性決定了化療的效果。本研究中Sunitinib作用于Lo Vo細(xì)胞后，電鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞體積縮小，胞膜完整但發(fā)生皺縮，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)向核膜邊緣凝聚、固縮、邊聚等凋亡的特異性變化。流式細(xì)胞儀還觀察到Sunitinib對腫瘤細(xì)胞DNA合成期及G2/M期的阻滯。

細(xì)胞凋亡是基因?qū)虻募?xì)胞自我消滅的過程，通過細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶，使核小體間的DNA裂解成碎片，繼而核裂解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。它是通過外源性或內(nèi)源性的凋亡信號，激活細(xì)胞內(nèi)編碼的自殺程序而促發(fā)的[6-7]。本實驗觀察到Sunitinib對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

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