厚樸酚通過自噬途徑促進(jìn)HepG-2細(xì)胞死亡

李海波,谷建軍,英錫相,關(guān)洪全

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧大連116600)

厚樸酚(Magnolol)是中藥厚樸的主要有效成分之一,是從厚樸中分離出的具烯丙基取代的聯(lián)苯酚類化合物。近年來,研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚具有抗炎、抗菌、肌肉松弛、抗腫瘤和抗氧化的作用[1-2]。但有關(guān)其抗腫瘤的作用機(jī)制缺乏探討。以人非小細(xì)胞性肺癌HepG-2細(xì)胞為材料,應(yīng)用MTT法及熒光顯微鏡等方法,研究不同濃度的厚樸酚誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制,報道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑 胎牛血清購自大連生物試劑公司。谷氨酰胺、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、HEPES、MTT、三氯乙酸(TCA)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、MDC、RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco(Grand Island,NY,USA);厚樸酚購自北京生物制品研究所,用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解(終濃度≤0.01%);經(jīng)HPLC檢測純度均大于98%。用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度,并經(jīng)0.22 μ m微孔濾器過濾除菌。熒光顯微鏡(Olympus,BX-51)。

1.2 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞性肺癌HepG-2細(xì)胞(購自American Type Culture Collection)。將處于對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞接種在含10%胎牛血清和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中,在飽和濕度,溫度為37℃,濃度為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞生長抑制實驗 取處于對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞,以每孔100 μ L接種于96孔板。24 h后分別加入厚樸酚(濃度 0,5,10,20,40,60,80,160 μ mol/L),加藥作用 6,12,24,48 h 后 ,每孔加入25 μ LMTT(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后,棄上清,每孔加入150 μ L DMSO溶解,酶標(biāo)儀492 nm檢測,繪制時效及量效曲線。

抑制率(%)=[A492(空白組)-A492(厚樸酚)]/A492(空白組)×100%

2.2 TUNEL法檢測4種細(xì)胞的凋亡率 取HepG-2細(xì)胞不同濃度的厚樸酚處理組和陽性藥物處理組,消化離心,制成細(xì)胞涂片。按TUNEL試劑盒說明書操作：樣本加蛋白酶K,37℃消化10 min,PBS漂洗后加標(biāo)記緩沖液10 μ L/片,室溫1 min,甩掉多余液體不洗。按每張片子取TdT和 Biotion-11-dUTP各1μ L,加入18 μ L標(biāo)記緩沖液中,混勻,加至標(biāo)本片上,置濕盒中4℃過夜,再37 ℃標(biāo)記2 h,2×SSC洗5 min×3次。加 1%乙?；?BSA 封閉液 10μ L/片,室溫20 min,甩掉封閉液不洗。加SAAP(鏈酶親和素堿性磷酸酶)20 μ L/片,37℃反應(yīng)30 min,PBS充分漂洗。BCIP/NBT 37℃顯色30 min,伊紅復(fù)染,細(xì)胞核中有紫藍(lán)色顆粒者為陽性細(xì)胞,即凋亡的肺癌細(xì)胞。顯微鏡下觀察拍照(×1 000)。同時分別以標(biāo)記緩沖液替代TdT和Biotion-11-dUTP作空白對照,以正常細(xì)胞培養(yǎng)組為正常對照。每組樣本隨機(jī)選擇10個區(qū)域,每個區(qū)域計數(shù)100個細(xì)胞,統(tǒng)計出凋亡的細(xì)胞數(shù),計算凋亡細(xì)胞所占百分率。

2.3 LDH活力檢測 乳酸脫氫酶(LDH)存在于細(xì)胞內(nèi),正常情況下,不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時,由于細(xì)胞膜通透性改變,LDH可從細(xì)胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH再催化乳酸的過程中,使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶(NADH2),后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)形成有色的甲基化合物,在490 nm或570 nm波長處有一吸收峰,利用讀取的A值,即可測得殺傷細(xì)胞毒活性。用LDH試劑盒(Zhongsheng LDH kit,Beijing,China)來檢測 LDH的活力,于 4℃下離心(240×g)5 min,分別測定培養(yǎng)板懸浮細(xì)胞中的LDH(LDHp)：作為凋亡指數(shù);上清液中LDH的量(LDHe)：作為壞死指數(shù);培養(yǎng)板中貼壁細(xì)胞LDH的量(LDHi)：作為細(xì)胞內(nèi)LDH指數(shù)。

凋亡與壞死的百分率計算如下：凋亡(%)=LDHp/(LDHp+LDHi+LDHe)×100 壞死(%)=LDHe/(LDHp+LDHi+LDHe)×100。

2.4 MDC染色法 MDC是一種熒光染料,可以被用作自噬泡的特異標(biāo)志物檢測自噬的發(fā)生[3],不同濃度的厚樸酚作用24 h后,加入50 μ mol/L MDC在37℃下作用1 h,并用4%多聚甲醛固定,于熒光顯微鏡下觀察。3-MA是自噬過程早期特異性自噬抑制劑,在培養(yǎng)于蓋玻片上的處于對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞中加入3-MA(0,5,10,20,40 mmol/L)預(yù)先處理10 h,再加入高濃度厚樸酚作用24 h后,MTT法觀察細(xì)胞的存活率。

2.5 統(tǒng)計分析 結(jié)果數(shù)據(jù)用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 厚樸酚對HepG-2細(xì)胞生長的抑制作用 不同濃度的厚樸酚于不同時間48 h HepG-2細(xì)胞后,細(xì)胞的存活率隨時間的增加而減少。可見厚樸酚對HepG-2細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用并呈明顯的劑量依賴性(圖 1)。低濃度(20 μ mol/L)刺激細(xì)胞的生長(圖2B),可能與厚樸酚的抗氧化作用相關(guān)[4],40 μ mol/L在一定程度上誘導(dǎo)了細(xì)胞的死亡,細(xì)胞變圓、漂浮(圖2C),80 μ mol/L發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞發(fā)生死亡(圖2D)。

3.2 厚樸酚處理的細(xì)胞中沒有伴隨凋亡的發(fā)生 由于厚樸酚能夠抑制HepG-2細(xì)胞的生長,接下來采用細(xì)胞周期分析藥物處理后的細(xì)胞周期變化,檢測LDH的活力,即0,20,40,80,160 μ mol/L厚樸酚處理48 h后,高濃度組(80,160 μ mol/L)細(xì)胞壞死,而對照組(0 μ mol/L)和低濃度組(20,40 μ mol/L)沒有壞死現(xiàn)象的發(fā)生(圖略)。

TUNEL法對細(xì)胞用Br-dUTP標(biāo)記,并用抗BrdUTP抗體染色,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度處理組的HepG-2細(xì)胞中,有很少的細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖3)。

圖1 厚樸酚對HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(mean±SD,n=3)

圖2 厚樸酚誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

圖3 TUNEL法檢測厚樸酚作用HepG-2細(xì)胞后的凋亡情況(mean±SD,n=3)

以上結(jié)果顯示,厚樸酚抑制HepG-2細(xì)胞的生長,不是通過細(xì)胞凋亡的途徑。

3.3 厚樸酚誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生自噬 MDC染色法檢測到,高濃度(80 μ mol/L)厚樸酚作用于HepG-2細(xì)胞24 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡(圖4c),3-MA(20mmol/L)預(yù)處理10 h后加80 μ mol/L的厚樸酚作用24 h的處理組可見空泡量減少(圖4b),在對照組未見或少見空泡的出現(xiàn)(圖4a)。

圖4 MDC染色法標(biāo)示厚樸酚誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞胞漿空泡

為了分析厚樸酚作用HepG-2細(xì)胞后產(chǎn)生的空泡現(xiàn)象,筆者采用自噬過程早期特異性自噬抑制劑3-MA進(jìn)行檢測,用濃度為5,10,20和40 mmol/L的3-MA分別作用細(xì)胞 10 min后,加入80 μ mol/L厚樸酚作用48 h,MTT法檢測細(xì)胞的存活率,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率上升,說明細(xì)胞自噬作用被抑制(圖5)。

圖5 3-MA對HepG-2細(xì)胞存活率的影響(mean±SD,n=3)

4 討論

近年來研究表明,厚樸酚具有細(xì)胞毒活性及抗氧化作用等廣泛的生物活性,有報道厚樸酚能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞(COLO-205)和人肝癌細(xì)胞(HepG-2)凋亡,從而抑制其增殖[5]。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱程序化細(xì)胞死亡(programmed cell death)是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程[6]。凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上最重要的特征是細(xì)胞核染色質(zhì)異常凝集,核固縮,繼而通過形成凋亡小體而消亡。自噬性細(xì)胞死亡是一種非凋亡性程序性細(xì)胞死亡,是一種降解胞質(zhì)內(nèi)容物的溶酶體途徑,可以降解細(xì)胞內(nèi)長期存在的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器[7]。自噬可以促進(jìn)壞死,與凋亡有所不同。自噬具有幫助細(xì)胞免于凋亡的作用,在應(yīng)激條件下自噬與凋亡常常同時出現(xiàn)[8]。在研究中,MTT法證明厚樸酚對人非小細(xì)胞性肺癌HepG-2細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,并呈明顯的時間依賴性。LDH活力檢測顯示高濃度厚樸酚可促進(jìn)HepG-2細(xì)胞壞死,更明確其具有細(xì)胞毒作用。而TUNEL法檢測時很少見高濃度的厚樸酚促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡,證明厚樸酚促進(jìn)HepG-2細(xì)胞死亡,不是通過凋亡途徑。MDC染色法表明高濃度厚樸酚作用后的細(xì)胞有大量胞漿內(nèi)空泡,與文獻(xiàn)描述的自噬過程出現(xiàn)的空泡相似[9],證明有自噬泡的產(chǎn)生。3-MA為特異性自噬抑制劑,對厚樸酚誘導(dǎo)的自噬過程具有很強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)自噬作用被3-MA抑制后,細(xì)胞死亡率比厚樸酚單獨作用時的細(xì)胞死亡率明顯減少,進(jìn)一步表明高濃度的厚樸酚作用可以誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生,出現(xiàn)自噬性細(xì)胞死亡。

綜上所述,厚樸酚可通過細(xì)胞自噬途徑而非凋亡途徑抑制HepG-2細(xì)胞生長。

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