嗜酸乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因克隆及其pMG36e表達(dá)載體的構(gòu)建

郎建華 趙國芬 李志剛 鄭 婷 包秋華

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸(linoleic acid，LA)衍生的共軛雙烯酸的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱。其中cis-9、trans-11和trans-10、cis-11兩種異構(gòu)體被證實具有很強(qiáng)的生理活性，具有抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、抗氧化、減肥、促進(jìn)生長、緩和免疫反應(yīng)副作用等優(yōu)點。

20世紀(jì)80年代起，人們開始逐漸了解到，一些微生物細(xì)胞中的亞油酸異構(gòu)酶 (linolenic acid isomerase,LAI)可催化亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸的反應(yīng)，并且反應(yīng)產(chǎn)物均為活性共軛亞油酸異構(gòu)體。亞油酸異構(gòu)酶最早發(fā)現(xiàn)于溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）中，之后，又發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）、棒桿菌（Cornebacterium ssp）等能產(chǎn)生亞油酸異構(gòu)酶。目前，有些菌種的亞油酸異構(gòu)酶已被分離純化。然而，這些菌種有些是厭氧的，不利于進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)酶培養(yǎng)；有些兼性厭氧菌生長較為緩慢，且生長會受到共軛亞油酸產(chǎn)物的抑制，并且傳統(tǒng)的CLA工業(yè)生產(chǎn)大多采用化學(xué)方法,存在產(chǎn)物難以分離、產(chǎn)物中含有環(huán)化副反應(yīng)、產(chǎn)品安全性低等問題，尚無法實際應(yīng)用。于是，構(gòu)建基因工程菌來表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶，就成為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)共軛亞油酸的一條重要途徑。

一些研究者開始將注意力轉(zhuǎn)移到一些厭氧條件相對不是很嚴(yán)格的菌種，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些具有共軛亞油酸轉(zhuǎn)化能力的兼性厭氧微生物，尤其是乳酸菌的研究和應(yīng)用價值逐漸顯現(xiàn)出來，目前，人們已發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬的多個種，如嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種（L delbrueckii subsp bulgaricus）、德氏乳酸桿菌亞種（L delbrueckii subsp Lactic）、羅伊氏乳桿菌（L reuteri）、干酪乳桿菌（L casei）、植物乳桿菌（L plantarum）,以及和乳桿菌密切相關(guān)的乳球菌屬（Lactococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和丙酸桿菌屬（Propionibacterium）的多個種都具有亞油酸異構(gòu)酶活性。曹健、相麗新（2007）等已對嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因克隆及表達(dá)進(jìn)行了研究。

本實驗將用嗜酸乳桿菌基因組為模板對LAI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后克隆入pMD-19T質(zhì)粒，再亞克隆到pMG36e質(zhì)粒中，構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-LAI，并轉(zhuǎn)化到DH5 α中,為利用工程菌工業(yè)化生產(chǎn)高產(chǎn)量、高活性亞油酸異構(gòu)酶制劑來生產(chǎn)CLA奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為本實驗室從益生菌酸奶發(fā)酵劑中分離出的菌株。E.coli JM109，為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物實驗室保存，用于質(zhì)粒pMG36e及其衍生質(zhì)粒的保存。E.coli JM109（pMG36e）為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品樓生物實驗室贈送。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基按照分子克隆實驗指南進(jìn)行配制。

1.1.3 酶及生化試劑

所用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、SphⅠ、異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal為大連寶生物公司產(chǎn)品。T4DNA連接酶、EX Taq DNA聚合酶、紅霉素均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

膠回收試劑盒為北京中科瑞泰公司產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒為Tian Gen公司產(chǎn)品。DNA連接試劑盒、pMD19-T試劑盒、DNA Marker均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要試劑及溶液

Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)、TE緩沖液(pH值8.0)、溶菌酶(20mg/ml)、SDS(10%、50 μl)、蛋白酶 K、NaCl(5 M100 μl)、CTAB/NaCl（10%/0.7 M）、酚/氯/異戊醇（25： 24： 1）、氯仿/異戊醇（24： 1）、預(yù)冷異丙醇 、預(yù)冷乙醇（70%）、氯化鈣 。

1.1.5 引物

根據(jù)從國際基因庫（Gen Bank）中下載的多條LAI基因序列，并結(jié)合國內(nèi)董理等人的報道，利用Primer 5.0軟件，針對pMG36e質(zhì)粒的多克隆位點，設(shè)計了一對PCR擴(kuò)增引物：

上游引物P1：

5'—AAAGTCGACATGTATTATTCCAAT-3'，（下 劃 線為SalⅠ酶切位點）；

下游引物P2：

5'—AAAGCATGCTTAGACTAAATTTGCTTC-3'，（下劃線為SphⅠ酶切位點）。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌總DNA的提取

用CATB法提取。

1.2.2 嗜酸乳桿菌LAI基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，循環(huán)條件為：94℃變性30 s，47℃退火 45 s，72℃延伸2 min；循環(huán)30輪后，72℃保溫6 min并終止反應(yīng)。

1.2.3 LAI基因PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

用膠回收試劑盒純化LAI基因PCR產(chǎn)物后和pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coli DH5 α，對陽性克隆用菌落PCR篩選及酶切鑒定。

1.2.4 LAI基因測序和氨基酸序列推測

篩選出含陽性克隆質(zhì)粒pMD19-T-LAI的陽性菌，送北京三博遠(yuǎn)志有限公司進(jìn)行序列分析并預(yù)測其氨基酸序列。

1.2.5 LAI基因新型表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將LAI基因從pMD-19T-LAI克隆質(zhì)粒上用SalⅠ、SphⅠ限制性內(nèi)切酶切下，重新對應(yīng)連接到用相同內(nèi)切酶雙酶切后的大腸桿菌/乳酸菌表達(dá)載體pMG36e上，并將重組質(zhì)粒pMG36e-LAI轉(zhuǎn)入E.coli DH5 α。

1.2.6 新型表達(dá)載體pMG36e-LAI的鑒定

挑選出轉(zhuǎn)化平板上陽性菌落，并通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行陽性克隆的初步篩選，然后提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切分析。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 LAI基因的PCR擴(kuò)增

用針對LAI基因設(shè)計的特異性引物以嗜酸乳桿菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示，2號泳道得到一條長約1.8 kb的特異性目標(biāo)帶，符合LAI基因的預(yù)期長度（1 776 bp）。

圖1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增

2.2 LAI基因的克隆及酶切鑒定

圖2 陽性克隆菌液PCR檢測結(jié)果

圖3 Sal I、Sph I雙酶切電泳檢測結(jié)果

將大量PCR產(chǎn)物電泳、凝膠回收并純化后，直接與pMD-19T (2 692 bp)載體連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色陽性克隆菌。陽性克隆菌落PCR結(jié)果見圖2。圖2中1、3、4號泳道均得到一條長約1.8 kb的特異性條帶，與預(yù)期的相同；提取其質(zhì)粒SphⅠ、SalⅠ雙酶切后，電泳檢測結(jié)果見圖3。圖3中2、3號均為陽性克隆質(zhì)粒（pMD-19TLAI）經(jīng)過雙酶切后，得到約1.8 kb和2.7 kb左右的片段，與我們插入的片段(1 776 bp)和質(zhì)粒pMD-19T大小一致，1號為pMD-19T-LAI質(zhì)粒，大小為4.4 kb，與預(yù)期的相符。證明陽性克隆質(zhì)粒pMD-19T-LAI構(gòu)建成功。

2.3 亞油酸異構(gòu)酶基因測序及其氨基酸序列預(yù)測

將陽性克隆菌DH5 α(pMD-19T-LAI)提交北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行克隆片段序列測定。

LAI基因序列測定及分析表明，ORF全長1 776 bp，編碼591個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量約67.6 kDa。

將該測定序列與Gen Bank中登錄號為CP000033的嗜酸乳桿菌NCFM菌株的亞油酸異構(gòu)酶基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，該菌株亞油酸異構(gòu)酶基因的核苷酸序列與NCFM中的核苷酸序列長度相同，都是1 776 bp，編碼591個氨基酸，兩段序列中在1 338位置有1個堿基不同，同源性高達(dá)99%，但所編碼的氨基酸序列并沒發(fā)生變化。

該基因測定序列與Gen Bank中登錄號為DQ239438的嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株的亞油酸異構(gòu)酶基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，該菌株亞油酸異構(gòu)酶基因的核苷酸序列與AS1.1854中的核苷酸序列長度相同，都是1 776 bp，編碼591個氨基酸，兩段序列中有4個堿基不同，同源性高達(dá)99%，導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列發(fā)生了變化。差別為該菌株編碼的氨基酸序列第157為E(谷氨酸)，第286為F（苯丙氨酸），第506為V（纈氨酸）；而AS1.1854菌株編碼的氨基酸序列對應(yīng)的為G（甘氨酸）、C(半胱氨酸)、A（丙氨酸）。其中G和E，以及C和F兩對氨基酸的極性不同，而A和V極性相同。

對該嗜酸乳桿菌和AS1.1854所編碼氨基酸序列用Bioediter7.0進(jìn)行疏水性分析,結(jié)果見圖4。由于兩蛋白質(zhì)間只存在3個氨基酸的差別，因此，其疏水性譜非常相似,在兩序列的N端均有一疏水區(qū)，可能存在信號肽。

圖4 嗜酸乳桿菌株(a)和AS1.1854(b)亞油酸異構(gòu)酶基因氨基酸疏水輪廓平均數(shù)圖譜(Bioediter7.0)

2.4 LAI基因新型表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

圖5 陽性克隆菌落PCR電泳結(jié)果

圖6 雙酶切質(zhì)粒pMG36e-LAI電泳檢測結(jié)果

將Sph I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙切后得到的LAI基因和pMG36e電泳、回收、純化、連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli DH5α，挑白色菌落進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖5，1、2、3號泳道均得到1.8 kb的片段，與目的片段大小相同；提取陽性克隆質(zhì)粒pMG36e-LAI進(jìn)行雙酶切結(jié)果如圖6，圖6中2號泳道出現(xiàn)了1.8 kb和3.4 kb左右的酶切片段，分別與目的片段 (1 776 bp)和pMG36e大小相同。圖5和圖6表明重組表達(dá)載體pMG36e-LAI構(gòu)建并轉(zhuǎn)化成功。

3 討論

通過設(shè)計特異性引物擴(kuò)增并克隆的LAI基因與現(xiàn)有報道的LAI序列高度相似，同源性為99%，可能是地域差異或不同亞種引起的，但預(yù)測的氨基酸順序和疏水性分析表明，該氨基酸序列與報道的氨基酸序列一致?？梢灶A(yù)測這個堿基的改變不會引起LAI基因功能的改變。

曹健等（2007）也對亞油酸異構(gòu)酶基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，不同的是他們利用的是嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株，表達(dá)載體是pET30a，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21株中表達(dá),在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白,首次表達(dá)出了可溶性的亞油酸異構(gòu)酶。

相麗新等（2007）利用植物乳桿菌 AS1·555,也克隆了亞油酸異構(gòu)酶，并將其克隆到pQE30質(zhì)粒載體上,進(jìn)行測序，結(jié)果表明與已報道的痤瘡丙酸桿菌共軛亞油酸異構(gòu)酶分子量(55 ku)相差較大,但與羅伊氏乳桿菌(70 ku)和短雙歧桿菌(70.5 ku)相近，其氨基酸序列與羅伊氏乳桿菌共軛亞油酸異構(gòu)酶只有32%的同源性,與痤瘡丙酸桿菌則沒有顯著同源性，說明了不同來源的共軛亞油酸異構(gòu)酶可能也存在物種多樣性或多形性。

4 結(jié)語

目前已成功構(gòu)建大腸桿菌pMG36e-LAI新型表達(dá)載體，如果能成功在大腸桿菌中高效表達(dá)，可嘗試轉(zhuǎn)入乳酸菌工程菌MG1363，并獲得大量表達(dá)，將為利用乳酸菌作為工程菌工業(yè)化生產(chǎn)獲得大量、高活性亞油酸異構(gòu)酶制劑，以及為研制多功能微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步構(gòu)建食品級表達(dá)載體獲得可食用益生菌劑提供理論依據(jù)。

15篇，刊略，需者可函索）