植酸酶的高密度發(fā)酵、制備及其應(yīng)用研究

龍 躍 楊 博 王永華 吳曉英 齊振雄

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱。磷是動(dòng)物體內(nèi)一種必需的礦物質(zhì)，在參與體內(nèi)正常的新陳代謝中起著重要的作用。磷還是骨骼的重要成分。畜禽必須從飼料中攝取足夠的磷,才能維持正常的生命活動(dòng)。如果飼料中缺磷，會(huì)導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，骨骼和牙齒發(fā)育不良，動(dòng)物生產(chǎn)性能降低等不良后果。在飼料中添加植酸酶,可以提高飼料的利用率,降低飼料系數(shù)和飼料成本,改善許多水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能,促進(jìn)其生長(zhǎng),所以植酸酶的應(yīng)用潛力很大。飼料中添加植酸酶可以減少磷酸二氫鈣的添加量,從而減少了磷源的浪費(fèi),同時(shí)降低了磷的排泄量,進(jìn)而減少了磷對(duì)水體環(huán)境的污染。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。它不但克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，表達(dá)的蛋白多形成包涵體，背景蛋白多，表達(dá)量不很高等缺陷，還具有與真核生物極其相似的分泌途徑和很強(qiáng)的真核蛋白質(zhì)修飾功能,并且其自身分泌的蛋白質(zhì)很少且易于高密度發(fā)酵,因此，在表達(dá)和分離純化異源蛋白質(zhì)等方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本研究主要是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的畢赤酵母產(chǎn)植酸酶基因工程菌的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，確定產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件,初步研究酶學(xué)特性，并且投入小規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用，為今后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)植酸酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

巴斯德畢赤酵母基因工程菌，甲醇營(yíng)養(yǎng)型，由華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基；固體平板培養(yǎng)基：液體YPD培養(yǎng)基加2%瓊脂；搖瓶生長(zhǎng)培養(yǎng)基：BMGY；搖瓶甲醇誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基：BMMY；發(fā)酵生長(zhǎng)培養(yǎng)基：26.7 ml/l 85%磷酸、0.93 g/l CaSO4·2H2O、18.2 g/l K2SO4·2H2O、14.9 g/l MgSO4·7H2O、7.13 g/l KOH、40 g/l甘油、4.35 ml/l微量元素；補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基：50%甘油、12 ml/l微量元素；誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基：100%甲醇、12 ml/l微量元素；微量元素：6 g/l CuSO4·5H2O、0.08 g/l NaI、3 g/l MnSO4·H2O、20 g/l ZnSO4·7H2O、65 g/l FeSO4·7H2O、0.5 g/l CoCl2·6H2O、0.02 g/l硼酸、5 ml/l濃硫酸（上述培養(yǎng)基均按“Invitrogen Pichia Fermentation Process Guidelines”推薦方法配制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

將菌種接于YPD平板，30℃培養(yǎng)2 d，4℃保藏；在平板上挑取單菌落接種至液體100 ml YPD中，28～30℃、250～300 r/min搖至菌體濃度OD600=2～6(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，大約16～18 h)；按10%接種量接種100 ml BMGY搖瓶中，28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)18～24 h；室溫1 500～3 000 g離心5 min收集細(xì)胞，去除上清，用相同體積BMMY重懸細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床28℃中繼續(xù)生長(zhǎng)。每隔24 h，加入甲醇至終濃度為1%以繼續(xù)誘導(dǎo)。檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，因?yàn)檎舭l(fā)作用會(huì)減少培養(yǎng)基的體積，誘導(dǎo)72 h后取樣測(cè)酶活力。

1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

種子制備：從YPD平板挑取單菌接種到100 ml種子培養(yǎng)基中，28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)16～18 h，做為一級(jí)種子；按10%接種量接入200 ml種子培養(yǎng)基中,28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)24 h，做為二級(jí)種子。

發(fā)酵罐準(zhǔn)備：30 L發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按10%接種量將二級(jí)種子接種在28℃進(jìn)行菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h，以18 ml/(L·h)流加50%甘油作為碳源補(bǔ)加4 h，使菌體達(dá)到一定的濃度，通過(guò)流加甲醇的補(bǔ)料方式，維持DO≥20%并且在26℃下進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶。pH值用氨水和磷酸調(diào)節(jié)。每隔4～6 h取1 ml培養(yǎng)基至1～5 ml離心管，室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心2～3 min。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。

1.3.3 酶活測(cè)定方法

酶活定義：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/l，溫度37℃，pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 甲醇添加量對(duì)表達(dá)量的影響

將10 ml菌液接入100 ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)24 h，離心后將菌體轉(zhuǎn)入相同體積含有甲醇百分比濃度分別為 0.5%、1%、1.5%、2%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),24 h后補(bǔ)加相同濃度的甲醇,誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后產(chǎn)酶結(jié)果如圖1。由圖1可以看出，甲醇百分比濃度為1.5%時(shí)酶活力達(dá)到最高，但甲醇濃度較高，達(dá)到2%時(shí)，酶活力開始下降。在重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵中,控制適宜的甲醇濃度十分重要。甲醇濃度過(guò)低，AOX1啟動(dòng)子不能有效啟動(dòng),外源基因則不能高效轉(zhuǎn)錄;甲醇濃度過(guò)高,會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。因此，甲醇濃度是實(shí)現(xiàn)外源蛋白高水平表達(dá)的保證。

2.1.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)量的影響

將10 ml菌液接入100 ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)24 h，離心后將菌體轉(zhuǎn)入相同體積含有1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMMY 中,分別在 22、26、30、34 ℃的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后產(chǎn)酶結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，采用不同的溫度進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)時(shí)，在22℃時(shí)酶活偏低，原因可能是溫度過(guò)低，抑制了細(xì)胞的活性，但26℃和30℃相比，溫度越低越有利于目的蛋白的表達(dá)，原因可能是低溫有利于降低蛋白合成速率與新生成肽鏈的折疊速率,低的蛋白合成速率及折疊速率有利于新生肽鏈的正確折疊。

2.1.3 生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響

將10 ml菌液分別接入100 ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY 中分別培養(yǎng) 18、20、22、24、26、28 h，離心后將菌體轉(zhuǎn)入制好的甲醇濃度1%的相同體積培養(yǎng)基BMMY中條件下誘導(dǎo)72 h后產(chǎn)酶結(jié)果如圖3。由圖3可以看出，在生長(zhǎng)20 h后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶酶活力較高，24 h后酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是因?yàn)檎T導(dǎo)前菌種處于平穩(wěn)期中后期，細(xì)胞的產(chǎn)酶能力減弱。

圖1 甲醇濃度對(duì)植酸酶表達(dá)的影響

圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)植酸酶表達(dá)的影響

圖3 生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)植酸酶表達(dá)的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響

從發(fā)酵開始，每隔4 h，取發(fā)酵液樣品測(cè)其OD600值和濕重，以最大轉(zhuǎn)速離心2～3 min，保留上清液，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)其植酸酶酶活大小，結(jié)果見圖4。由圖4可知，細(xì)胞在培養(yǎng)20 h后，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)過(guò)4 h的補(bǔ)加甘油后，菌體密度迅速增加達(dá)到OD600=173，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，在24 h，以4 ml/(L·h)的甲醇流加速度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，由圖4可以看出，發(fā)酵24～108 h（誘導(dǎo)時(shí)間0～84 h）酶活逐漸呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵108 h（誘導(dǎo)時(shí)間84 h）后，雖然菌體濃度一直增大，但酶活力開始下降。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，植酸酶表達(dá)水平開始下降。原因有兩點(diǎn)：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞同時(shí)也會(huì)分泌大量的蛋白酶，表達(dá)外源細(xì)胞被水解；二是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，受發(fā)酵條件的限制，菌體進(jìn)入平穩(wěn)期后期，表達(dá)蛋白的能力逐漸喪失。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)植酸酶表達(dá)及菌體生長(zhǎng)的影響

2.1.5 流加甲醇補(bǔ)料策略對(duì)表達(dá)量的影響

在誘導(dǎo)補(bǔ)加甲醇期間，分別采用不同的補(bǔ)料流加策略——甲醇： 甘油為4：0、5：0、5：1、5：2、6：0，其他條件一致的情況下，結(jié)果如圖5。由圖5可知，隨著甲醇和甘油的流加速度增大，菌體濃度OD600不斷升高，在甲醇流加速度高于5 ml/(L·h)后，菌體濃度開始下降，溶氧（DO）逐漸變大，說(shuō)明此時(shí)甲醇在發(fā)酵液中開始積累，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。在誘導(dǎo)階段混合流加碳源過(guò)程中，甘油流速超過(guò)1 ml/(L·h)時(shí)，酶活力開始下降，但菌體濃度還是持續(xù)上升，說(shuō)明甘油在發(fā)酵液中作為第一碳源首先被利用，對(duì)甲醇的誘導(dǎo)作用形成抑制。因此，該結(jié)果表明，最佳的誘導(dǎo)補(bǔ)料策略是混合碳源補(bǔ)料，并且甲醇：甘油為5：1。

2.1.6 誘導(dǎo)pH值對(duì)表達(dá)量的影響

用氨水和磷酸調(diào)節(jié)誘導(dǎo)期的pH值，取不同水平為 5.5、5.0、4.5、4.0、3.5，其他條件一致。結(jié)果如圖 6。由圖6可知，隨著誘導(dǎo)期pH值的變小，菌體濃度OD600也不斷降低，但是酶活力的曲線呈先增大后變小的趨勢(shì)，說(shuō)明在pH值為4.0～5.0之間，較低的pH值不適合細(xì)胞生長(zhǎng)，但有利于植酸酶的表達(dá)，原因是誘導(dǎo)劑甲醇對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，不利于高密度的發(fā)酵，但是低pH值抑制了蛋白酶的活性，提高了單位酶活力。在pH值低于4.0的情況下，由于細(xì)胞總濃度的偏低，導(dǎo)致了單位酶活的降低，pH值為4.0時(shí)的植酸酶活性比pH值為4.5時(shí)的植酸酶活性提高了近20%，因此，既利于生長(zhǎng)又利于植酸酶表達(dá)的pH值為4.0左右。

圖5 甲醇補(bǔ)料策略對(duì)植酸酶表達(dá)及菌體生長(zhǎng)的影響

圖6 誘導(dǎo)pH值對(duì)植酸酶表達(dá)及菌體生長(zhǎng)的影響

2.2 植酸酶的酶學(xué)特性及制備

2.2.1 植酸酶的最適pH值和溫度耐受性

將產(chǎn)酶菌種誘導(dǎo)84 h后，取培養(yǎng)液離心，上清液進(jìn)行酶活性檢測(cè)。酶活檢測(cè)底物為植酸鈉，用一系列緩沖溶液配制，pH值范圍為3～10，結(jié)果如圖7所示，植酸酶在pH值3～6之間能保持55%以上的活力，pH值為5時(shí)，酶活力最高。植酸酶在最適pH值下，活性中心的各個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈質(zhì)子化或去質(zhì)子化解離較容易，使得催化反應(yīng)能迅速、高效進(jìn)行。過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)對(duì)酶活性中心氨基酸殘基側(cè)鏈的解離程度造成影響,阻礙反應(yīng)的順利進(jìn)行。

分別將酶液在50～90℃條件下進(jìn)行10 min耐熱性處理后進(jìn)行酶活性檢測(cè)，如圖8。由圖8可以發(fā)現(xiàn)，在50～70℃內(nèi)酶活力逐漸下降，而在70～90℃酶活力開始上升，并且在90℃時(shí)能保持75%的酶活力，具有良好的高溫耐熱性。飼料加工需經(jīng)過(guò)制粒工藝，在制粒過(guò)程中有一個(gè)短暫的高溫過(guò)程，一般的植酸酶活性在此高溫下大幅度地不可逆喪失，所以飼料中真正得到推廣利用的植酸酶必須具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖8 不同溫度下植酸酶的耐熱性能

2.2.2 不同濃縮方法對(duì)植酸酶活力的影響

硫酸銨沉淀法：取酶液，緩慢加入研磨的硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，待硫酸銨全部溶解后繼續(xù)攪拌10～15 min，使硫酸銨的飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%，10 000 r/min離心 20 min，沉淀用適量乙酸緩沖液溶解后，測(cè)其植酸酶酶活，酶活損失都在50%以上。

超濾法：將發(fā)酵后的液體用水平離心機(jī)，4℃、11 000～12 000 r/min離心10～15 min后，取上清液，經(jīng)過(guò)30 kD的膜包超濾濃縮，工藝流程如圖9。超濾后的酶液體積為超濾前的1/10，單位酶活提高了大約9倍，損失率小于10%。

圖9 植酸酶后處理工藝流程

2.2.3 不同穩(wěn)定劑對(duì)植酸酶穩(wěn)定性的影響

將金屬離子、陰離子、多糖、多元醇和表面活性劑等復(fù)合穩(wěn)定劑處理濃縮后的植酸酶并進(jìn)行飼料加工。分別將未處理和處理后獲得的飼料放在編織袋中，取剛加工后、保存1個(gè)月及2個(gè)月后飼料中的樣品檢測(cè)植酸酶的活性，與加入飼料前測(cè)定的活性比為其在飼料中保存的活性存留率，結(jié)果如圖10所示，添加穩(wěn)定劑可增加植酸酶的穩(wěn)定性，保存2個(gè)月后酶活存留率仍有50%以上。鹽的添加能顯著改善酶的穩(wěn)定性，鹽類主要存在離子鍵作用，當(dāng)酶的活性中心含有離子作為配位體時(shí)，鹽離子就能穩(wěn)定酶的構(gòu)象并且可作為水分子的替代物占據(jù)水的位置，排除自由水對(duì)酶造成的不穩(wěn)定化影響。而多羥基化合物既可通過(guò)氫鍵與酶蛋白表面分子相連結(jié)，也能通過(guò)氫鍵有效地與外部水分子相連結(jié)，使酶蛋白分子穩(wěn)定。

圖10 復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)植酸酶穩(wěn)定性的影響

2.3 植酸酶在草魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用

酶液經(jīng)濃縮，添加穩(wěn)定劑后投入小規(guī)模養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。采用初始平均體重5.3 g的草魚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，平行實(shí)驗(yàn)3組，每缸30尾，實(shí)驗(yàn)時(shí)間56 d，根據(jù)表1的配方對(duì)比本實(shí)驗(yàn)植酸酶的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，由圖11可知，本實(shí)驗(yàn)室植酸酶添加量0.08%時(shí)，單尾平均增重率達(dá)到75%，添加磷酸二氫鈣1.5%，單尾平均增重率76%，基本可以完全替代磷酸二氫鈣，但需進(jìn)一步放大實(shí)驗(yàn)確定。

表1 飼料配方（%）

圖11 不同配方對(duì)單尾平均增重率的影響

3 結(jié)論

發(fā)酵條件主要包括培養(yǎng)基、接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、甲醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等,本研究以該菌株在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化為前提的基礎(chǔ)上，在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件為：生長(zhǎng)時(shí)間20h、甲醇流加速度 5 ml/(L·h)、誘導(dǎo)期甘油流速1 ml/(L·h)、誘導(dǎo)pH值4，誘導(dǎo)時(shí)間84 h、誘導(dǎo)溫度26℃，酶活力可達(dá)到454 U/ml，比未優(yōu)化前提高289%。初步對(duì)酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的pH作用范圍為3～6，并且在90℃處理后，仍然可以保持75%的活性，具有一定的耐熱性。

酶液經(jīng)過(guò)超濾濃縮損失率小于10%，加入復(fù)合穩(wěn)定劑投入飼料加工后酶活存留率大于60%，保存2個(gè)月仍有50%以上，投入到草魚養(yǎng)殖實(shí)際的應(yīng)用中，得到結(jié)果當(dāng)添加比率為0.08%時(shí)基本可以完全替代磷酸二氫鈣，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室畢赤酵母工程菌具有大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的前景。

[1]Sreekrishna K,Brankamp R G,Kropp K E,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene,1997,190(1):55-62.

[2]Hong F,Meinander N Q,Jonsson L J.Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase in Pichia pastoris[J].Biotechnology and Bioengineering,2002,79(4):438-449.

[3]Romanos M.Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene expression[J].Current Opinion in Biotechnology,1995,6(5):527-533.

[4]灑榮波,石貴陽(yáng),王正祥.基因工程菌Pichia pastoris高密度培養(yǎng)條件的搖瓶研究[J].食品研究與開發(fā),2005,26(2):52-56.

[5]全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).GB/T18634-2002[S].中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).

[6]劉志偉,黃玉亭,張鐵鷹,等.國(guó)標(biāo)法測(cè)定植酸酶活性存在問(wèn)題的探討[J].中國(guó)飼料,2006（18）:29-31.

[7]竇燁,王清路,李俏俏.畢赤酵母工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2008(6):168-171.

[8]金虎,肖杰,段生兵,等.畢赤酵母流加培養(yǎng)誘導(dǎo)生產(chǎn)植酸酶的流加控制策略[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(10):9-16.

[9]李洪釗,李亮助,孫強(qiáng)明,等.巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化策略[J].微生物學(xué)報(bào),2003,43(2).

[10]謝子文,王紅寧.畢赤酵母工程菌產(chǎn)植酸酶補(bǔ)料分批發(fā)酵研究[J].中國(guó)釀造,2007(6):9-13.

[11]付石軍,孫建義.改善植酸酶熱穩(wěn)定性的策略[J].中國(guó)飼料,2007（14）:26-28.

[12]劉梅英,彭健,劉敏躍,等.從后處理工藝提高植酸酶熱穩(wěn)定性的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2007,28(11):1-3.