益生菌對凡納對蝦生長性能和消化酶活性的影響研究

王彥波 傅玲琳

對蝦養(yǎng)殖在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位，然而，日益嚴重的生態(tài)環(huán)境和疾病一直威脅著對蝦的養(yǎng)殖和安全（Kesarcodi-Watson等，2008）。研究表明，傳統(tǒng)的抗生素等抗菌化學(xué)藥物的大量使用甚至濫用不僅擾亂了對蝦腸道正常的菌群，引起耐藥菌株的產(chǎn)生，而且造成環(huán)境中藥物的殘留，最終威脅著人類的健康和安全，這些問題已引起了人們廣泛的關(guān)注與焦慮（Esiobu等，2002）。因此，如何有效地尋找抗生素類化學(xué)藥物的替代品成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和熱點（Wang等，2008）。

細菌在自然界的生物類群中具有重要的作用和地位（Wang等，2005）。早在 1980年，Yasuda等就已預(yù)言，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中某些細菌不論作為餌料、疾病的生物防治劑還是再生循環(huán)的催化劑，都將發(fā)揮其重大作用（Verschuere等，2000）。這些細菌后來擴展為一種活的微生物飼料添加劑即益生菌，通過改善腸道內(nèi)菌群平衡而對動物產(chǎn)生有益的影響（Fuller,1989）。這引起了國內(nèi)外水產(chǎn)學(xué)家的普遍關(guān)注，掀起了益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用研究的熱潮，并有望成為安全替代抗生素的一個重要方向（Balcázar等，2006）。然而，功能型復(fù)合益生菌對養(yǎng)殖前期凡納對蝦的應(yīng)用效果研究鮮見。鑒于此，本研究以目前廣泛養(yǎng)殖的凡納對蝦（Penaeus vannamei）為試驗動物，研究餌料中添加一定濃度的功能型復(fù)合益生菌對其生長性能、成活率和消化酶活性的影響，旨在為水產(chǎn)飼料益生菌添加劑的研發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

功能型復(fù)合益生菌包括等量的凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.lincheniformis）、乳酸乳球菌（L.lactis）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）以及屎腸球菌（E.faecium），冷凍干燥后保存?zhèn)溆?，總活菌?shù)為1×1010cfu/g。健康凡納對蝦由浙江蕭山對蝦育苗場提供，經(jīng)水泥池暫養(yǎng)7 d后備用，暫養(yǎng)期間每天飼喂3次基礎(chǔ)日糧。試驗基礎(chǔ)日糧購自寧波天邦股份有限公司，飼喂前均勻添加一定濃度的復(fù)合益生菌，終濃度分別為0、1.0、3.0和5.0 g/kg飼料（濕重）。

1.2 試驗方法

1.2.1 飼養(yǎng)試驗

選取體重均一（約0.7 g）的健康凡納對蝦，隨機分成4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)50尾蝦。以濕重計，分別飼喂添加功能型復(fù)合益生菌濃度的日糧。飼養(yǎng)試驗在水族箱中進行，實際水體積為250 L，水溫25～28℃，ACO-318型空氣壓縮機增氧，保持水中溶解氧濃度大于5.0mg/l。每日投餌3次，自由采食。每天觀察對蝦的健康狀況并記錄死亡數(shù)量，試驗期間每天換水1次，每次換水量為試驗水族箱水量的1/10左右，試驗周期為28 d。

1.2.2 指標測定

正式飼養(yǎng)試驗前對蝦的體重定義為初重，飼養(yǎng)試驗結(jié)束前停飼24 h，全組稱重，定義為末重，計算相對增重率并統(tǒng)計成活率。其中相對增重率（%）=[（末重-初重）/初重]×100；成活率（%）=（末尾數(shù)/初尾數(shù)）×100。每個水族箱中隨機抽取6尾對蝦制備粗酶液，取出腸道樣本后用去離子水沖洗，濾紙吸干，迅速稱重并用玻璃勻漿器勻漿，定容后-4℃條件下離心20 min（5 000 r/min），取上清液保存?zhèn)溆?。凡納對蝦腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性測定分別參照García-Carre?o等（1997）、Worthington（1993）和 Borlongan（1990），3 種酶的活性表示為U/g腸容物。試驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準偏差，采用SAS6.12統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析，若組間差異顯著，再作LSD多重比較，顯著水平P值采用0.05。

2 試驗結(jié)果（見表1）

表1 益生菌對凡納對蝦生長性能和成活率的影響

從表1可見，不同濃度的復(fù)合益生菌對凡納對蝦部分生長性能具有顯著的影響。各組間初重沒有顯著差異，經(jīng)過28 d的飼養(yǎng)試驗，試驗組-2和試驗組-3的末重和相對增重率均顯著（P＜0.05）高于對照組和試驗組-1，但是對照組和試驗組-1比較差異不顯著，同樣試驗組-2和試驗組-3之間也沒有顯著差異。與對照組比較，添加較高濃度的益生菌（試驗組-2和試驗組-3）可以顯著（P＜0.05）提高凡納對蝦的成活率，但是，試驗組-2和試驗組-3之間同樣差異不顯著。與試驗組-1比較，添加高濃度益生菌的試驗組-2和試驗組-3在成活率上雖然有不同程度的提高，但是差異不顯著。此外，試驗組-1與對照組之間在成活率上也沒有顯著的差異。

不同濃度的復(fù)合益生菌對凡納對蝦腸道消化酶活性的影響參見圖1、圖2和圖3。由圖1可見，不同濃度的復(fù)合益生菌對凡納對蝦腸道蛋白酶活性具有一定的影響。與對照組和試驗組-1比較，添加3.0 g/kg和5.0 g/kg的復(fù)合益生菌（試驗組-2和試驗組-3）均顯著提高了（P＜0.05）凡納對蝦消化道蛋白酶的活性，但試驗組-2和試驗組-3之間差異不顯著。結(jié)果顯示，添加低濃度（1.0 g/kg，試驗組-1）復(fù)合益生菌雖然提高了凡納對蝦消化道蛋白酶的活性（658±45）U/g，但是與對照組（551±54）U/g比較，差異不顯著。不同濃度的復(fù)合益生菌對凡納對蝦腸道淀粉酶活性的影響與蛋白酶的統(tǒng)計結(jié)果相一致，見圖2。與對照組和試驗組-1比較，試驗組-2和試驗組-3中凡納對蝦消化道淀粉酶具有較高的活性（P＜0.05）。不同濃度的復(fù)合益生菌對凡納對蝦腸道脂肪酶活性的影響見圖3。

從圖3可見，與對照組比較，試驗組-2和試驗組-3同樣顯示出較高的（P＜0.05）消化道脂肪酶活力，但是試驗組-2和試驗組-3之間差異不顯著。與對照組和高濃度益生菌添加組（試驗組-2和試驗組-3）比較，添加低濃度益生菌（試驗組-1）對凡納對蝦腸道脂肪酶活力沒有顯著的影響。

圖1 不同濃度的益生菌對凡納對蝦腸道蛋白酶活性的影響

圖2 不同濃度的益生菌對凡納對蝦腸道淀粉酶活性的影響

圖3 不同濃度的益生菌對凡納對蝦腸道脂肪酶活性的影響

3 討論

研究結(jié)果顯示，飼料中復(fù)合益生菌活菌的數(shù)量對使用效果具有一定影響，當復(fù)合益生菌添加濃度高于1.0 g/kg時，凡納對蝦的末重和相對增重率均顯著高于對照組和低劑量組（試驗組-1），這表明益生菌活菌數(shù)量是一個影響其作用效果的重要因素。益生菌通過在動物腸道定植和代謝發(fā)揮其益生作用，益生菌數(shù)量的多少可能直接影響其在腸道定植的幾率，進而影響到其功能（Wang等，2008）。益生菌作為飼料添加劑在其他水生動物上的試驗同樣表明，益生菌可以顯著促進動物的生長性能（Macey等，2005;Wang等，2006;丁賢等,2004;楊奇慧等，2009；王彥波,2010）。但是，本試驗結(jié)果同樣表明，飼料中添加復(fù)合益生菌對凡納對蝦生長性能的促進作用并不隨著益生菌添加量的增加而顯著上升，試驗組-2和試驗組-3在末重和相對增重率上差異不顯著，這說明益生菌活菌的數(shù)量僅是影響其功能的一個重要的因素，益生菌的益生作用除了受到自身的影響以外，還受動物本身的生理基礎(chǔ)條件（年齡、性別、健康狀況等）和外界環(huán)境因素（如水體溫度、pH值等水質(zhì)指標以及池塘其他微生物種群與數(shù)量）等的影響（Balcázar等，2006）。

成活率是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的評價指標，直接關(guān)系到養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。本試驗結(jié)果表明，添加高濃度復(fù)合益生菌（試驗組-2和試驗組-3）顯著提高了凡納對蝦的成活率，分別為94.67%和95.33%，均高出對照組（86.00%）8個百分點，這與在凡納對蝦生長性能上的研究結(jié)果相吻合。結(jié)果顯示，3個試驗組之間成活率差異并不顯著，沒有數(shù)量依賴性，這可能與可控的試驗條件有關(guān)。綜合生長性能和成活率的測定結(jié)果，結(jié)合經(jīng)濟成本，試驗組-2的復(fù)合益生菌添加劑量較為適當，即添加3.0 g/kg。

消化酶是由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的具有促消化作用的一類酶類，蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)在消化酶的作用下分解，通過吸收途徑進入血液循環(huán)供機體利用，因此，消化酶對于水產(chǎn)動物的生長和發(fā)育具有重要的作用（唐黎等,2007）。Ziaei-Nejad等（2006）研究結(jié)果表明，一定濃度的芽孢桿菌顯著提高了（P＜0.05）印度白對蝦（Fenneropenaeus indicus）腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性。本試驗結(jié)果同樣證實了這一現(xiàn)象，與對照組比較，添加較高劑量復(fù)合益生菌的試驗組-2和試驗組-3顯著提高了凡納對蝦腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性。這說明凡納對蝦腸道對蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力得到了提高，對蝦機體可以利用更多的營養(yǎng)物質(zhì)，這與試驗組-2和試驗組-3在生長性能和成活率上的測定統(tǒng)計結(jié)果一致，這也是從腸道酶學(xué)特性揭示了復(fù)合益生菌的作用機理。研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌等芽孢桿菌屬的益生菌可以分泌多種胞外消化酶（Moriarty,1996、1998）。因此，從試驗組-2和試驗組-3結(jié)果顯示的顯著提高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶活性肯定與復(fù)合益生菌中豐富的胞外酶具有一定的關(guān)聯(lián)，但是復(fù)合益生菌分泌胞外酶的貢獻率還有待于進一步研究。

[1]Balcázar J L,Blas I,Ruiz-Zarzuela I,et al.The role of probiotics in aquaculture[J].Veterinary Microbiology.2006,114:173-186.

[2]Borlongan I G.Studies on the digestive lipases of milkfish,Chanos chanos[J].Aquaculture,1990,89:315-325.

[3]Esiobu N,Armenta L,Ike J.Antibiotic resistance in soil and water environments[J].Int.J.Environ.Health Res.,2002,12:133-144.

[4]Fuller R.Probiotics in man and animals [J].Journal of Applied Bacteriology,1989,66:365-378.

[5]García-Carre?oF L,Toro A N,et al.Digestive shrimp proteases for evaluation of protein digestibility in vitro [J].Journal of Marine Biotechnology.,1997,5:36-40.

[6]Kesarcodi-Watson A,Kaspar H,Lategan M J,et al.Probiotics in aquaculture:The need,principles and mechanisms of action and screening processes[J].Aquaculture,2008,274:1-14.

[7]Macey B M,Coyne V E.Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J].Aquaculture,2005,245:249-261.

[8]Moriarty D J W.Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds[J].Aquaculture,1998,164:351-358.

[9]Moriarty D J W.Microbial biotechnology:a key ingredient for sustainable aquaculture[J].Info.fish Int.,1996,4:29-33.

[10]Verschuere L,Rombaut G,Sorgeloos P,et al.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2000,64:655-671.

[11]Wang Y B,Li J R,Lin J.Probiotics in aquaculture:Challenges and outlook[J].Aquaculture.2008,281:1-4.

[12]Wang Y B,Xu Z R.Effect of probiotics for common carp(Cyprinus carpio)based on growth performance and digestive enzyme activities[J].Animal Feed Science&Technology,2006,127:283-292.

[13]Wang Y B,Xu Z R,Zhou X X,et al.Bacteria attached to suspended particles in Northern White Shrimp (Penaeus vannamei L.)ponds[J].2005,249:285-290.

[14]WorthingtonV.WorthingtonEnzymeManual[M].EnzymesandRelatedBiochemicalsWorthingtonChemicalPress,NewJersey,US.1993.

[15]Ziaei-Nejad S,Rezaei M H,Takami G A,et al.The effect of Bacillus spp.bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity,survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus[J].Aquaculture.2006,252:516-524.

[16]丁賢,李卓佳,陳永青,等.芽孢桿菌對凡納對蝦生長和消化酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2004(11):580-584.

[17]唐黎,王吉橋,程駿馳,等.水產(chǎn)動物消化酶的研究[J].飼料工業(yè),2007,28:28-31.

[18]王彥波.益生菌B.coagulans對羅非魚生長性能和肌肉營養(yǎng)成分的影響研究[J].飼料工業(yè),2010(S1):74-77.

[19]楊奇慧,周小秋.飼料中添加微生態(tài)制劑對奧尼羅非魚生長、飼料利用和抗病力的影響[J].飼料廣角,2009(12):36-39.