不同單酶制劑混合檢測對比研究

湯海鷗 高秀華 黃 輝

復(fù)合酶制劑以綜合各種單酶于一體為優(yōu)勢已經(jīng)在飼料中得到廣泛應(yīng)用，而且在畜牧業(yè)生產(chǎn)中起到了重要的作用，并起到了非常明顯的效果。復(fù)合酶多以單株菌種發(fā)酵再以互補(bǔ)復(fù)配的方式進(jìn)行生產(chǎn)，因其含有單酶品種多，在進(jìn)行酶制劑檢測的過程中各單酶之間可能存在的干擾一直妨礙著復(fù)合酶制劑活性的準(zhǔn)確測定，例如酸性蛋白酶是否會影響其他酶制劑活性的表達(dá)等[1]。鑒于此，本試驗(yàn)以各種單酶為研究對象用不同方式進(jìn)行混合，再進(jìn)行測定酶活，以研究復(fù)合酶檢測過程中存在的問題和正確的測定方法，為商品復(fù)合酶制劑產(chǎn)品的酶活測定和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶樣品由北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)中以測定的酶活實(shí)際值為準(zhǔn)。

1.2 木聚糖酶活力測定方法

1.2.1 酶活定義

樣品在溫度37℃、pH值5.5的條件下，1 min內(nèi)從燕麥木聚糖（濃度為1%）中產(chǎn)生了1 μmol木糖所需的酶量，為一個(gè)木聚糖酶活性單位（U）。

1.2.2 底物（1%燕麥木聚糖）配置

稱取1.00 g燕麥木聚糖，用80 ml左右的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液溶解，于70℃下磁力攪拌半小時(shí)，冷涼后用醋酸調(diào)至pH值5.5，轉(zhuǎn)入容量瓶中，用緩沖液定容至100 ml。離心機(jī)4 000 r/min離心10 min后取上清液備用。4℃避光保存，有效期為3 d。

1.2.3 DNS試劑配置

稱取3,5-二硝基水楊酸3.15 g，加水500 ml，水浴至45℃，逐步加入100 ml 0.05 mol/l氫氧化鈉溶液，不斷攪拌，直到溶液清澈透明，再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g，補(bǔ)加水300 ml，攪拌，溶解后停止加熱冷卻至室溫，用水定容至1 000 ml。儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7 d后可以使用，有效期為6個(gè)月。

1.2.4 酶樣測定步驟

在試管中加入1.8 ml 1.0%的木聚糖底物，加入酶液 200 μl，37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng) 10 min，加入 3.0 ml DNS 試劑，沸水浴5 min，空白制作時(shí)DNS先于酶液之前加入。540 nm波長處測定OD值。從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得木糖含量，計(jì)算酶活力單位。

1.2.5 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取15 ml刻度管7支，加入磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，再分別加 10 μmol/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml，以緩沖液為空白，反應(yīng)測定步驟同1.2.4節(jié)。

1.3 纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶活力測定方法

纖維素酶酶活測定參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 912—2004[2]，淀粉酶和酸性蛋白酶酶活測定參照中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 1803—1993[3]。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 各單酶活性的測定

分別測定木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶的活性，并測定各單酶中含有的其他3種酶活量（測定過程中，每個(gè)樣平行取3份，結(jié)果取平均值，下同）。

1.4.2 酸性蛋白酶對其他酶活性的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)采取完全隨機(jī)的3×1×3設(shè)計(jì)方式：按照梯度1、0.5、0.1 g稱取木聚糖酶樣品（所有樣品稱量值保留四位有效數(shù)字），分別與0.2 g的酸性蛋白酶混合，酶提40 min，測定酶活，纖維素酶和淀粉酶同樣按照木聚糖酶試驗(yàn)設(shè)計(jì)方式進(jìn)行試驗(yàn)，以上設(shè)計(jì)同比設(shè)定兩個(gè)處理溫度（20、37℃）。

1.4.3 四種單酶整體混合試驗(yàn)

稱取木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶各10 g，將4種酶制劑混合在一起，用各酶相對應(yīng)的緩沖液酶提40 min，然后測定各種酶的活性，并與原酶活測定值進(jìn)行對比分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 各單酶活性的測定

供試木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶樣品的酶活測定結(jié)果，及各單酶中其他3種酶活含量如表1。

表1 供試樣品酶活測定結(jié)果（U/g）

由表1可以看出：4個(gè)樣品中除了木聚糖酶樣品外，其他3個(gè)酶制劑都含有一定量的木聚糖酶活性，其中尤其是纖維素酶樣品中含有較多量的木聚糖酶；非纖維素酶樣品中也都含有一定量的纖維素酶活性，其中以酸性蛋白酶樣品中纖維素酶活性含量較高；除淀粉酶和酸性蛋白酶樣品本身外，其他酶制劑中未檢測出淀粉酶和酸性蛋白酶活性，這主要原因可能與酶制劑的誘導(dǎo)物和分泌方式有關(guān)，相對于木聚糖酶和纖維素酶，淀粉酶和酸性蛋白酶對誘導(dǎo)物的要求更嚴(yán)格，且分泌方式多以胞內(nèi)為主[4]。

2.2 酸性蛋白酶對其他酶活性的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)按1.4.2節(jié)進(jìn)行混合后，各酶制劑不同混合比例不同溫度下測定酶活值如表2。

將表2的酶活測定值與原酶活測定值進(jìn)行比較，二者之間的相對誤差值如表3。

從表2和表3結(jié)果可以看出，所有酶活測定結(jié)果和原酶活值之間的相對誤差都在酶制劑檢測允許誤差8%之內(nèi)，且所有相對誤差都未超過3%，這說明酸性蛋白酶并沒有對其他酶制劑產(chǎn)品酶活產(chǎn)生很大的影響。同樣從不同溫度對比結(jié)果可以看出，酶提溫度的改變對酶活也沒有產(chǎn)生顯著影響。

2.3 四種單酶整體混合試驗(yàn)結(jié)果

表2 酸性蛋白酶和不同酶制劑不同混合比例下各酶酶活測定值(U/g)

表3 表2測定酶活值與原酶活值之間的相對誤差計(jì)算結(jié)果(%)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照1.4.3節(jié)進(jìn)行混合后，對樣品進(jìn)行各種單酶活性的測定，將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（即混合產(chǎn)生的質(zhì)量倍數(shù)4），并與混合前四種樣品中含酶總量進(jìn)行對比，計(jì)算混合前后的相對誤差值見表4。

表4 四種單酶混合后酶活測定值及與混合前酶活總量之間的相對誤差結(jié)果

從表4結(jié)果可以看出，除木聚糖酶外，其他3種酶制劑的相對誤差都不到3%，在酶制劑檢測允許誤差范圍8%之內(nèi)，這說明各種酶制劑相互混合對纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶檢測沒有影響；木聚糖酶混合后的測定值和總酶活相對誤差值比較大，分析其原因可能是淀粉酶在酶提的過程中和載體淀粉發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生還原糖造成的，木聚糖酶酶活的檢測原理是利用指示劑顯色酶解過程產(chǎn)生的還原糖的量來判定酶活。

鑒于以上分析，試驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步論證，將木聚糖酶、纖維素酶和酸性蛋白酶按照1.4.3節(jié)混合方式進(jìn)行對比檢測。并將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（即混合產(chǎn)生的質(zhì)量倍數(shù)3），與混合前3種樣品中含酶總量進(jìn)行對比，計(jì)算混合前后間的相對誤差值見表5。

表5 3種單酶混合后酶活測定值及與混合前酶活總量之間的相對誤差結(jié)果

從表5結(jié)果可以看出，除去淀粉酶后3種酶制劑檢測酶活值都在3%之內(nèi)，木聚糖酶混合后的測定值和總酶活相對誤差值為2.9%，遠(yuǎn)小于酶制劑檢測允許誤差范圍8%，這說明排除淀粉酶產(chǎn)生還原糖的干擾后酶活檢測可以達(dá)到非常準(zhǔn)確的判定。

3 討論

因?yàn)閺?fù)合酶中含有酶種多，各單酶間的相互干擾因素比較復(fù)雜，尤其是一些以還原糖顯色為判定標(biāo)準(zhǔn)的酶活檢測方法易受復(fù)合酶中產(chǎn)生還原糖的干擾，所以復(fù)合酶的準(zhǔn)確測定一直是復(fù)合酶質(zhì)量判定的一大難題。本試驗(yàn)主要目的就是利用各種已知酶活樣品進(jìn)行混合后再測定混合樣中各單酶酶活變化情況，以便研究復(fù)合酶中各單酶活性的檢測方法。

在實(shí)際復(fù)合酶制劑檢測過程中各單酶活性測定受影響因素主要有兩種：一是酶制劑本身對其他酶制劑酶活產(chǎn)生的影響，如酸性蛋白酶；二是酶制劑和載體在酶提的過程中發(fā)生酶解反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物對其他酶制劑活性檢測產(chǎn)生的影響，如淀粉酶。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對于試驗(yàn)選用的4種酶制劑檢測酶活值易受干擾的主要是木聚糖酶，其他3種酶制劑酶活測定值受酶制劑混合產(chǎn)生的影響很小；而木聚糖酶在排除淀粉酶的干擾后酶活檢測值基本不受影響。本試驗(yàn)在選材的過程中根據(jù)酶制劑發(fā)酵產(chǎn)生方式和復(fù)合酶實(shí)際含單酶情況，選取兩類具有代表性的4種酶制劑，其他酶制劑可以根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)做類似的推斷，也可以進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確論證。

[1]聶國興,李春喜,明紅,等.不同浸提方案對飼用木聚糖酶活性測定結(jié)果的影響[J].飼料工業(yè),2003,24(9):35-37.

[2]農(nóng)業(yè)部全國飼料工作辦公室,中國飼料工業(yè)協(xié)會,全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會等.NY/T 912—2004.飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法[A].飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編(2002～2006)[C].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

[3]全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.QB/T 1803—1993.工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法[A].白酒標(biāo)準(zhǔn)匯編(第二版)[C].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.

[4]Astrid R.Stricker·Robert L.Mach·Leo H.de Graaff.Regulation of transcription of cellulases-and hemicellulases-encoding genes in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,78:211-220.