高效液相色譜法檢測(cè)福美雙在蔬菜及土壤中的殘留

孟凡立，崔兆豐，王志坤，李文濱*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030；2.撫遠(yuǎn)縣出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 撫遠(yuǎn) 156500）

福美雙是一種具有保護(hù)作用的硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，化學(xué)名稱為二硫化四甲基秋蘭姆。其抗菌廣譜，對(duì)黃瓜霜霉病、番茄、瓜類猝倒病、立枯病、禾谷類白粉病、黑穗病和多種作物的苗立枯病等均有較好的效果，是良好的種子處理劑和土壤處理劑。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法中有GC法、GC-MS法、原子吸收法及HPLC-MS法等[1-4]，國(guó)內(nèi)多使用檢測(cè)二硫代氨基甲酸酯的水解產(chǎn)物-CS2，即通過(guò)酸性水解使福美雙分解為CS2，從而檢測(cè)蔬菜中福美雙的殘留量[1-2]。二硫代氨基甲酸酯類殺菌劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為3類，分別為二甲基二硫代氨基甲酸酯類（福美雙、福美鐵等）、乙撐雙二硫代氨基甲酸鹽類（代森錳鋅、代森鋅等）和丙烯基雙二硫代氨基甲酸酯類（丙森鋅），此3類物質(zhì)均可水解產(chǎn)生CS2，故以CS2法進(jìn)行福美雙殘留量測(cè)定缺乏專一性，且測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也不好。根據(jù)Gustafsson等報(bào)道的在福美雙含量分析中采用的衍生化原理[5]，上述3類物質(zhì)能夠產(chǎn)生不同的衍生產(chǎn)物，因此能夠分別檢測(cè)這3類殘留。本研究利用上述衍生原理，建立了福美雙在黃瓜、番茄和土壤中殘留檢測(cè)方法，為進(jìn)行福美雙在復(fù)雜基質(zhì)中的殘留檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100（G1315A DAD）型高效液相色譜儀；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器；申勝R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵；SPS 202F型電子天平；金怡TDL-50臺(tái)式大容量離心機(jī)；便攜式酸度計(jì)（Checker-Hanna Instruments）；渦旋式振蕩器（VTX-3000L）；Millex針頭式過(guò)濾器，0.45 μm。

福美雙標(biāo)樣（純度99%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；L-半胱氨酸鹽酸無(wú)水物（99%，上海生工生物工程有限公司）；EDTA二鈉二水合物（99%，Gene-Tech Co.,Ltd.）；四丁基硫酸氫銨（99%，ACROS Organic）；甲醇、乙腈為UV級(jí)純；二氯甲烷、正己烷、氯化鈉、碘甲烷等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將采來(lái)的土壤樣本去除雜草、碎石等，充分?jǐn)嚢杌靹颍稽S瓜及番茄樣本先切成片，再經(jīng)組織搗碎機(jī)粉碎后，混合均勻。所有樣本低溫保存（-20℃）。

1.2.2 溶液配制

將100 g·L-1半胱氨酸鹽酸鹽與186.9 g EDTANa2及2 L蒸餾水、36 g NaOH于燒杯中溶解，配制成pH 9.5～9.6的L-半胱氨酸鹽酸鹽和EDTA-Na2混合溶液備用（下稱溶液Ⅰ）；配制含有0.05 mol·L-1碘甲烷的二氯甲烷-正己烷（1：1，體積比）混合溶液備用（下稱溶液Ⅱ）。

準(zhǔn)確稱取福美雙標(biāo)樣0.0505 g（準(zhǔn)確至0.2 mg）于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成濃度為1 000 mg·L-1的標(biāo)樣儲(chǔ)備液，于冰箱4℃儲(chǔ)存。

1.2.3 樣品的提取及衍生化

稱取20 g處理好樣品于250 mL三角瓶中，加入100 mL溶液Ⅰ，密封，室溫條件下（25±5℃）使用空氣浴機(jī)械振蕩器在130 r·min-1下，劇烈震蕩10 min轉(zhuǎn)移至離心管中，再在4 000 r·min-1下離心5 min轉(zhuǎn)移上清液于250 mL三角瓶中；樣品殘?jiān)儆?0 mL溶液Ⅰ渦旋2 min提取，步驟同上，合并上清液于250 mL三角瓶中，攪拌下用6 mol·L-1的鹽酸調(diào) pH 8.0 加 5 mL 0.41 mol·L-1的四丁基硫酸氫銨水溶液，調(diào)pH 7.0攪拌下加入40 mL溶液Ⅱ，劇烈震蕩10 min，靜置10 min棄水層，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于100 mL離心管中，于4 000 r·min-1下離心5 min。棄水層，有機(jī)相用少量無(wú)水硫酸鈉干燥，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL平底燒瓶中加入5 mL 2-丙二醇-二氯甲烷（1：4，體積比）溶液，于30℃水浴中旋蒸濃縮，殘留物用1 mL甲醇定容，經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.4 儀器條件

色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 m·L-1；進(jìn)樣量：20 μL；DAD波長(zhǎng)選用272 nm；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（20：28：52，體積比）；儀器為四元泵配置，采用等梯度流動(dòng)相洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在1.2.4的色譜條件下，黃瓜、番茄及土壤樣品中福美雙甲基化衍生物的色譜峰與溶劑峰及干擾峰完全分離，結(jié)果見(jiàn)圖1～4。化合物的保留時(shí)間為6.1～6.3 min。

準(zhǔn)確配制 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg·L-1的福美雙標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法（見(jiàn)1.2.3）進(jìn)行操作。在1.2.4的色譜條件下進(jìn)樣，并以福美雙衍生物的峰面積-福美雙濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=26.611x-7.9339，r2=0.9996?？梢?jiàn)在1～50 mg·L-1范圍內(nèi)響應(yīng)峰面積與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 福美雙標(biāo)樣的液相色譜Fig.1 HPLC chromatogra h of thiram standard sample

圖2 土壤空白及0.5 mg·kg-1福美雙標(biāo)樣添加液相色譜Fig.2 HPLC chromatograph of blank soils sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

圖3 黃瓜空白及0.5 mg·kg-1福美雙標(biāo)樣添加液相色譜Fig.3 HPLC chromatograph of blank cucumber sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

圖4 番茄空白及0.5 mg·kg-1福美雙標(biāo)樣添加液相色譜Fig.4 HPLC chromatograph of blank tomato sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

2.2 精密度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性

采用同一供試樣品溶液，在相同色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，多次測(cè)定的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%，說(shuō)明本方法有較好的精密度。

在空白樣品中準(zhǔn)確加入一定量的福美雙標(biāo)準(zhǔn)品，按同樣的操作步驟進(jìn)行提取、衍生、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。在黃瓜、番茄和土壤中福美雙的添加濃度在0.05～2.0 mg·kg-1范圍內(nèi)，平均回收率分別為74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，變異系數(shù)分別為 0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在農(nóng)藥殘留測(cè)定所允許的范圍內(nèi)（回收率：70%～120%，變異系數(shù)≤15%），表明該方法準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性滿足殘留分析要求。

表1 樣品中福美雙標(biāo)樣添加回收率結(jié)果（n=5）Table 1 Average recovery and relative standard deviation of thiram in samples at 0.05～2.0 mg·kg-1fortification level(n=5)

分別以噪音信號(hào)的3倍和10倍確定方法的最低檢出限（LOD）為 0.02 mg·kg-1，最低檢測(cè)濃度為0.05 mg·kg-1（均以福美雙含量計(jì)）。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于福美雙在蔬菜或土壤中的殘留檢測(cè)方法主要有分光光度法（商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0525-1996）、GC-CS2法（地方標(biāo)準(zhǔn) DB11/T 379-2006）、二氯甲烷萃取法[6-8]。其中分光光度法檢測(cè)存在假陽(yáng)性情況，且檢出限過(guò)高（0.3 mg·kg-1）已不能滿足當(dāng)前福美雙殘留檢測(cè)要求。GC-CS2法最低檢出限為0.005～0.02 mg·kg-1，但是由于 CS2在食品（如大米、蔬菜等）及土壤樣本中普遍存在，這會(huì)嚴(yán)重干擾福美雙痕量殘留的定量檢測(cè)。二氯甲烷萃取法操作較簡(jiǎn)便，但經(jīng)研究表明，二氯甲烷萃取過(guò)程中乳化嚴(yán)重，且回收率偏低（＜70%）。本方法利用福美雙在堿性EDTA-Na2溶液中降解，再經(jīng)甲基化處理，最后由HPLC測(cè)定該甲基化產(chǎn)物，方法簡(jiǎn)單、可靠。我國(guó)規(guī)定二硫代氨基甲酸鹽（酯）類殺菌劑在果蔬中最大殘留限量（MRL）為 2 mg·kg-1，歐盟為 0.5～3 mg·kg-1，該方法均滿足檢測(cè)要求。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用甲基衍生化-HPLC法，建立了福美雙在蔬菜及土壤中的殘留檢測(cè)方法，方法回收率為74.3%～101.8%，變異系數(shù)為0.7%～6.3%，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。本方法無(wú)需復(fù)雜的凈化處理，直接使用液相色譜檢測(cè)，即可達(dá)到殘留分析的目的，且簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠。

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