口蹄疫病毒VP1基因siRNA重組腺病毒的構(gòu)建及其介導(dǎo)的RNAi抑制口蹄疫病毒復(fù)制的研究

賈俊濤,陳立軍,趙明秋,琚春梅,呂英然,陳金頂

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

口蹄疫(FMD)是引起偶蹄類動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。目前,使用傳統(tǒng)滅活疫苗免疫和撲殺相結(jié)合仍是防控口蹄疫的主要措施。但是仍然不能控制口蹄疫病毒(FMDV)的感染與傳播,這就促使人們尋求有效的措施防控口蹄疫。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新的能在體外有效抑制病毒復(fù)制的方法,是由與靶基因序列同源的dsRNA引發(fā)的廣泛存在于動(dòng)植物中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過(guò)程[2]。腺病毒載體因具有感染細(xì)胞種類多、感染效率高、外源基因表達(dá)水平高且既適于體外又適于體內(nèi)研究等特點(diǎn)而被作為轉(zhuǎn)基因載體[3]。本研究成功構(gòu)建了攜帶有O型FMDV VP1基因 siRNA片段的重組腺病毒質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞,獲得了重組腺病毒。觀察攜帶有FMDV基因siRNA片段的重組腺病毒在細(xì)胞水平對(duì)FMDV復(fù)制的抑制效果,從而對(duì)腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制FMDV增殖的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和毒株 質(zhì)粒 pSIREN-shuttle、pAdeno-X,細(xì)胞 HEK293、IBRS-2 和 FMDV O/HKN/2003由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)pAdeno-X序列和PISce I、I-Ceu I的識(shí)別序列,設(shè)計(jì)如下引物:P1:5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′;P2:5′-CATCAAACGAGT TGGTGCT-3′。

1.3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒的獲得 根據(jù) siRNA的設(shè)計(jì)原則[4],選擇VP1基因保守序列作為可能的干擾位點(diǎn),合成了含有siRNA序列的寡核苷酸片段,將其克隆到pSIREN-Shuttle中,經(jīng)過(guò)鑒定獲得陽(yáng)性克隆。

1.4 重組腺病毒的獲得 將1.4中的重組質(zhì)粒及pAdeno-X分別進(jìn)行 I-Ceu I、PI-Sce I雙酶切,連接酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化DH5α。以P1、P2為引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR,篩選陽(yáng)性克隆。PCR條件:94℃5 min,94℃45 s,50℃45 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。并采用Pac I酶切及測(cè)序鑒定,得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAdeno-VP1。

1.5 重組腺病毒的包裝及擴(kuò)增 制備pAdeno-VP1,Pac I酶切,然后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后20d出現(xiàn)明顯的CPE,經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定,獲得了重組腺病毒rA-deno-VP1,并進(jìn)行重組腺病毒的純化和滴度測(cè)定。

1.6 重組腺病毒抑制FMDV在IBRS-2中的復(fù)制將rAdeno-VP1以MOI=10的量感染IBRS-2細(xì)胞,吸附 12 h后,加入 100TCID50的 FMDV O/HKN/2003,觀察細(xì)胞變化,并在BHK-21細(xì)胞上測(cè)定感染 FMDV 12 h、24 h 、36 h 、48 h、60 h 、72 h 時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中FMDV的TCID50。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-VP1的鑒定 以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定,擴(kuò)增出600 bp左右大小的條帶,與預(yù)期相符(圖1)。將可能的陽(yáng)性重組子用 Pac I酶切后出現(xiàn)兩條亮帶,一條在3000 bp左右,另一條在30 kb左右,與預(yù)期相符(圖2)。將質(zhì)粒PCR鑒定為陽(yáng)性的 pAdeno-VP1進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果與預(yù)期序列完全吻合。結(jié)果表明,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 腺病毒的包裝及增殖 重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切線性化后,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后第7～10天開(kāi)始出現(xiàn)CPE,以后幾天CPE在逐漸增加;在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后15～20 d,細(xì)胞出現(xiàn)完全病變,大量細(xì)胞脫壁浮起,細(xì)胞聚集呈葡萄串狀(圖3),20 d時(shí)CPE細(xì)胞可達(dá)到80%～90%,收獲病毒。

圖3 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染16 d時(shí)的293細(xì)胞(200×)

2.3 重組腺病毒rAdeno-VP1基因組DNA的PCR鑒定 轉(zhuǎn)染獲得包裝病毒后,取增殖到第3、7、10代重組腺病毒提取病毒總DNA做為PCR擴(kuò)增的模板,以 P1/P2作為引物進(jìn)行 PCR,均擴(kuò)增出598 bp大小的條帶,而正常的HEK293細(xì)胞無(wú)條帶(圖4)。證明重組腺病毒包裝成功并進(jìn)行了增殖。

圖4 重組腺病毒rAdeno-VP1 PCR鑒定

2.4 重組腺病毒的增殖、純化及滴度測(cè)定 用經(jīng)過(guò)鑒定正確的rAdeno-VP1感染293細(xì)胞以大量增殖病毒,一般在感染后3～5 d出現(xiàn)明顯的CPE,離心收集細(xì)胞。純化后,獲得純化病毒液。用終點(diǎn)稀釋法計(jì)算出病毒滴度為2.5×109PFU/mL。

2.5 重組腺病毒抑制FMDV在IBRS-2中的復(fù)制rAdeno-VP1和FMDV共感染IBRS-2細(xì)胞后12 h、24 h、36 h、48 h 、60 h 、72 h 觀察 CPE 情況,并測(cè)定細(xì)胞上清中FMDV的TCID50。結(jié)果顯示:感染10 MOI rAdeno-VP1的 IBRS-2細(xì)胞,在 72 h之內(nèi)無(wú)明顯的CPE。細(xì)胞上清液病毒滴度測(cè)定結(jié)果與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符,細(xì)胞上清中FMDV的病毒滴度較低,而病毒對(duì)照的病毒滴度相對(duì)較高(表1)。說(shuō)明重組腺病毒能夠抑制FMDV在IBRS-2細(xì)胞中的復(fù)制。

表1 不同時(shí)間細(xì)胞上清中FMDV滴度(TCID50/100μL)

3 討論

口蹄疫是目前危害世界養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。盡管FMDV滅活疫苗已成為防治該病的重要手段之一,但其免疫效果仍不夠理想。RNA干擾是近年來(lái)產(chǎn)生的一項(xiàng)新的研究基因表達(dá)、調(diào)控和功能的生物技術(shù),迅速發(fā)展的RNAi技術(shù)已經(jīng)使其成為一種功能強(qiáng)大的研究動(dòng)物特定基因表達(dá)和功能的工具[2]。迄今為止,有大量文獻(xiàn)表明,通過(guò)人工轉(zhuǎn)染siRNA能夠有效地誘發(fā) RNAi抵抗病毒的感染[5-6]。本研究選擇了FMDV VP1基因保守序列作為可能的干擾位點(diǎn),合成了含有相應(yīng)siRNA序列的寡核苷酸片段。VP1基因在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用,是理想的siRNA靶標(biāo),因此,如果VP1基因的表達(dá)被抑制,就會(huì)抑制病毒的增殖。

RNAi表達(dá)載體有質(zhì)粒載體[7]和病毒載體[8-9],其中病毒載體克服了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率低的缺點(diǎn),并可體內(nèi)應(yīng)用,可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的靶基因沉默,具有臨床應(yīng)用前景等優(yōu)勢(shì)。本研究采用的就是復(fù)制缺陷型腺病毒載體,用HEK293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建了攜帶有FMDV VP1基因siRNA片段的重組腺病毒。并使用純化試劑盒進(jìn)行了純化,獲得了較高滴度Adeno-X重組腺病毒,為腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制FMDV在細(xì)胞中的復(fù)制打下了基礎(chǔ)。

口蹄疫病毒的基因組是一條單鏈RNA,其既作為mRNA又作為復(fù)制模板行使功能,因此口蹄疫是利用RNA干擾技術(shù)防制的理想對(duì)象。本研究選用的細(xì)胞是豬腎細(xì)胞IBRS-2,重組腺病毒只能感染該細(xì)胞,但不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,而FMDV則能在IBRS-2細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。所以我們用重組腺病毒和FMDV共感染IBRS-2細(xì)胞,通過(guò)觀察細(xì)胞變化情況及測(cè)定細(xì)胞上清液中FMDV的病毒滴度來(lái)檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制FMDV在IBRS-2細(xì)胞中復(fù)制的效果。我們的研究表明,特異性的siRNA的重組腺病毒能夠保護(hù)抑制FMDV在IBRS-2細(xì)胞中的復(fù)制。

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