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    靈丹菌質(zhì)雙向發(fā)酵工藝及藥效品質(zhì)研究*

    2010-08-08 02:17:26許曉燕鄭林用余夢(mèng)瑤
    中國(guó)食用菌 2010年2期
    關(guān)鍵詞:靈丹三萜丹參酮

    許曉燕,鄭林用,李 艷,江 南,余夢(mèng)瑤,羅 霞**

    (1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,四川 成都 610066;3.成都市經(jīng)濟(jì)信息中心,四川 成都 610041)

    靈芝(Ganoderma lucidum)是一種廣泛應(yīng)用的藥、食兼用真菌,具有促進(jìn)睡眠、緩解機(jī)體疲勞、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗HIV等功效[1]。近年來(lái),莊毅等提出用現(xiàn)代生物技術(shù)來(lái)改造靈芝等藥用真菌,即 “藥用真菌新型固體發(fā)酵工程”,在發(fā)酵基質(zhì)中增用具有活性成分的各種中藥材作為藥性基質(zhì),使發(fā)酵的作用不僅是提供營(yíng)養(yǎng)成分,而且因真菌的分解和合成作用產(chǎn)生新的成分,使其性質(zhì)發(fā)生變化,從而使藥用真菌和中藥材原有功效增強(qiáng),甚至可以產(chǎn)生新的性味、功能,這就具有雙向性,其發(fā)酵產(chǎn)物稱為菌質(zhì)[2]。

    丹參,為唇形科鼠尾草屬丹參 (Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖,始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消痛、消腫止痛等功效。在丹參采摘、加工過(guò)程中,除去入藥的部分,會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄?,F(xiàn)代研究表明,邊角料中具有與藥材相似的化學(xué)成分,只是含量較低,將其直接廢棄,不僅對(duì)環(huán)境造成污染,而且浪費(fèi)了大量具有潛在價(jià)值的資源。

    本論文采用新型(雙向性)固體發(fā)酵工程技術(shù),以靈芝為發(fā)酵菌株,在其培養(yǎng)基中增添丹參邊角料,通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化,初步建立靈丹菌質(zhì)的生產(chǎn)工藝,并檢測(cè)靈丹菌質(zhì)的理化指標(biāo)(蛋白質(zhì)、多糖、三萜等),開(kāi)展其活血化瘀的藥效學(xué)研究,旨在為現(xiàn)代菌物藥的研發(fā)提供一種新材料。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株

    美國(guó)大靈芝(Ganoderma sp.),中國(guó)農(nóng)大生物學(xué)院食用菌研究室提供。

    1.1.2 試驗(yàn)藥材

    丹參邊角料,購(gòu)自四川省中江縣;丹參藥材,購(gòu)自四川省成都市中藥材市場(chǎng)。

    1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

    昆明種小鼠,由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(川實(shí)質(zhì)第2002-33號(hào))。

    1.1.4 主要試劑

    蒽酮(上?;瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠);考馬斯亮藍(lán)G-250(上海朗瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司);丹參酮ⅡA、齊墩果酸(中國(guó)藥品生物制定鑒定所)。

    1.1.5 主要儀器

    智能光照培養(yǎng)箱,型號(hào):ZGX-300C,杭州錢(qián)龍儀器設(shè)備有限公司;紫外分光光度計(jì),型號(hào):T6新世紀(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HPLC系統(tǒng),型號(hào):Waters 1525,Waters公司;Syncore多樣品定量濃縮儀,瑞士Buchi。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 發(fā)酵樣品制備

    靈丹菌質(zhì)不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。

    表1 靈丹菌質(zhì)不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方比例

    按表1配置各組合固體發(fā)酵培養(yǎng)基,控制含水量在60%左右,分裝入袋,115℃滅菌3 h,冷卻后,接入靈芝斜面菌絲(以長(zhǎng)度1.0 cm菌絲體為標(biāo)準(zhǔn)),于恒溫 (27±2)℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.2.2 菌絲體日平均生長(zhǎng)速度觀察

    從菌絲體萌發(fā)起,記錄發(fā)酵過(guò)程中靈芝菌絲體在各組合培養(yǎng)基質(zhì)上的平均生長(zhǎng)速度。

    1.2.3 靈丹菌質(zhì)多糖、蛋白質(zhì)和三萜測(cè)定

    多糖含量測(cè)定采用2005版藥典規(guī)定方法[3]硫酸-蒽酮法,蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法,三萜含量測(cè)定采用草醛冰醋酸-高氯酸顯色法[4]。

    1.2.4 靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量的HPLC分析

    HPLC條件為檢測(cè)流動(dòng)相:甲醇∶水=75∶25;檢測(cè)溫度:30℃; 進(jìn)樣量為20 μL; 流速:1 mL·min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm。檢測(cè)方法為取菌質(zhì)粉末0.1 g,加入10 mL甲醇,封閉試管口,超聲提取10 min,靜置過(guò)夜,HPLC測(cè)定。

    1.2.5 試藥制備

    (1)水提:取定量樣品,加10倍蒸餾水,90℃水浴2.5 h,3000 r·min-1離心30 min,取上清;沉淀再加5倍水、3倍水,同法熱提2次;收集3次熱提所得上清液。

    (2)醇提:向水提后的樣品中加入2倍體積的95%乙醇,超聲提取 3 h,3000 r·min-1離心30 min,收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至結(jié)晶。

    (3)將步驟(2)所得結(jié)晶溶于步驟(1)中所得提取液,揮發(fā)至所需濃度即為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥樣品。

    1.2.6 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用

    參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

    1.2.7 對(duì)小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響

    參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

    1.2.8 對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響

    參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

    1.2.9 對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響

    參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)基組合菌絲體生長(zhǎng)速度的觀察

    從靈芝菌絲體萌發(fā)開(kāi)始,以2 d~3 d為1個(gè)時(shí)間單位,記錄菌絲體在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度,得到靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度曲線,如圖1所示。

    圖1 靈芝在不同組合中的菌絲體生長(zhǎng)速度

    從圖1可以看出,菌絲生長(zhǎng)可分為5個(gè)階段:適應(yīng)生長(zhǎng)期,菌絲生長(zhǎng)較慢,菌絲較纖弱;旺盛期,菌絲活力較強(qiáng),代謝旺盛,生長(zhǎng)快;下降期,菌絲生長(zhǎng)速度急劇下降;回升期,菌絲生長(zhǎng)速度有所回升;衰退期,菌絲活力衰退,菌絲老齡化,開(kāi)始分泌黃褐色素。結(jié)果表明,菌絲生長(zhǎng)至接種大約15 d后,生長(zhǎng)速度趨于平穩(wěn)且緩慢下降,至30 d后,生長(zhǎng)速度趨于平緩不變。

    2.2 不同靈丹菌質(zhì)組合的多糖含量

    測(cè)定發(fā)酵40 d后,菌質(zhì)的多糖含量,如圖2所示。

    從圖2可以看出,發(fā)酵40 d后,菌質(zhì)組合4的多糖含量最高。

    2.3 不同靈丹菌質(zhì)組合的蛋白含量

    發(fā)酵40 d后,測(cè)定菌質(zhì)的蛋白質(zhì)含量,測(cè)定結(jié)果如

    圖2 各組合靈丹菌質(zhì)多糖含量變化

    圖3所示。

    圖3 各組合靈丹菌質(zhì)蛋白含量變化

    從圖3可以看出,發(fā)酵40 d后,菌質(zhì)組合4的蛋白質(zhì)含量最高。

    2.4 不同靈丹菌質(zhì)組合的靈芝酸三萜含量

    發(fā)酵40 d后,測(cè)定菌質(zhì)的三萜含量,測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

    圖4 各組合靈丹菌質(zhì)三萜含量

    隨著丹參邊角料添加比例的逐漸增大,三萜的含量也基本呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),提示靈丹菌質(zhì)中三萜的含量可能與添加的藥材比例相關(guān)。

    2.5 不同靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量

    發(fā)酵40 d后,測(cè)定菌質(zhì)的丹參酮IIA含量,測(cè)定結(jié)果如表圖5所示。

    圖5 各組合靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量

    從圖5可以看出,組合3和組合4的丹參酮IIA含量最高且相同。

    2.6 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用

    從圖2~圖5可以看出,靈丹菌質(zhì)組合4在40 d中止發(fā)酵后,發(fā)酵產(chǎn)物多糖、蛋白質(zhì)、三萜和丹參酮IIA含量較高,因此選取組合4的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活血化瘀的藥效學(xué)研究。

    2.6.1 對(duì)急性不完全腦缺血小鼠的作用

    觀察靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

    表2 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用(x±s,n=10)

    相比空白對(duì)照組,丹參藥材組、組合4對(duì)急性不完全腦缺血小鼠的存活時(shí)間均無(wú)明顯的延長(zhǎng)作用,但是組合4具有一定的作用趨勢(shì)。

    2.6.2 對(duì)斷頭后小鼠喘息時(shí)間(急性腦缺氧)的影響

    觀察靈丹菌質(zhì)組合小鼠斷頭后急性腦缺氧的保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,相比空白對(duì)照組,丹參組、組合4對(duì)斷頭后急性腦缺氧小鼠的喘氣時(shí)間均無(wú)延長(zhǎng)作用,但對(duì)小鼠斷頭造成的急性腦缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)P投?,短暫延長(zhǎng)斷頭小鼠喘氣時(shí)間數(shù)秒,仍可視為對(duì)小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用,因此,組合4對(duì)小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用。

    2.7 對(duì)小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響

    觀察靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

    表3 靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠凝血、尾出血時(shí)間的影響(x±s,n=10)

    相比空白對(duì)照組,組合4給藥組的小鼠凝血時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組(p<0.05)。

    2.8 對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響

    觀察靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,相比空白對(duì)照組,組合4給藥組的小鼠尾出血時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組(p<0.05)。

    2.9 對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響

    觀察靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

    注射角叉菜膠24 h后,組合4就表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成作用(p<0.01);48 h后,丹參藥材組也表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成的作用(p<0.01);72 h后,2個(gè)給藥組均表現(xiàn)出一定的抑制血栓形成的作用。

    表4 靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響(x±s,n=10)

    3 討論

    在傳統(tǒng)的固體發(fā)酵中,基質(zhì)的作用僅是單向性地為真菌生長(zhǎng)提供所需碳、氮等營(yíng)養(yǎng),以獲得子實(shí)體為目的,很少注意發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)本身的變化,以及不同基質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外的研究者已開(kāi)始研究在培養(yǎng)基中加入藥用植物,進(jìn)行固體發(fā)酵來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì),如槐芪菌質(zhì)[6]、韓國(guó)藥性米酒[7]。本試驗(yàn)選用中藥材為靈芝的培養(yǎng)基質(zhì)之一,不僅觀察了在培養(yǎng)基質(zhì)中添加不同比例的丹參藥材后,靈芝生長(zhǎng)情況及菌質(zhì)多糖、蛋白質(zhì)、三萜、丹參酮的變化趨勢(shì),還進(jìn)行了菌質(zhì)提取物活血化瘀的藥效學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,從菌絲體日平均生長(zhǎng)曲線圖可以看出,在組合2、組合3、組合4三個(gè)培養(yǎng)基中,靈芝的生長(zhǎng)速度較快,其中在組合4中,其生長(zhǎng)最快(0.62 cm·d-1)。從多糖、蛋白質(zhì)、三萜、丹參酮的含量來(lái)看,40 d后,組合4的多糖、蛋白質(zhì)、靈芝酸三萜、丹參酮含量較高。綜合前面生長(zhǎng)情況和成分分析的結(jié)果,選取組合4進(jìn)行小鼠活血化瘀的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。藥效試驗(yàn)表明,靈丹菌質(zhì)在腦缺血、缺氧和活血化瘀方面具有比丹參藥材更好的功效;組合4同時(shí)具有延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間、尾出血時(shí)間和抗血栓的作用,表現(xiàn)出良好的活血化瘀功效。

    本研究表明,利用有益菌進(jìn)行雙向發(fā)酵能夠有效提高中藥基質(zhì)中的藥用成分,能夠?yàn)榫锼幯邪l(fā)提供一種新材料和新思路,并證實(shí)了新型固體發(fā)酵這種思路的合理性。

    [1]Russell R,Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry,2006,67(2): 1985-2001.

    [2]莊毅,潘揚(yáng),謝小梅.藥用真菌 “雙向發(fā)酵”的起源、發(fā)展及其優(yōu)勢(shì)與潛力[J].中國(guó)食用菌,2007,26(2):3-6.

    [3]國(guó)家藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

    [4]鄭林用,黃小琴,曾瑾.不同靈芝菌株多糖、三萜化合物比較分析[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007(5):1121-1124.

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