牛血清白蛋白對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏作用

萬明怡，周夢云，龍玉梅，嚴(yán)吉林，屠一鋒

（蘇州大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇 蘇州 215123）

電化學(xué)發(fā)光(ECL)分析是基于電化學(xué)反應(yīng)引發(fā)的化學(xué)發(fā)光而建立起來的一種分析方法［1-3］，常用的發(fā)光試劑有魯米諾、聯(lián)吡啶釕等，電化學(xué)氧化可使這些發(fā)光試劑氧化激發(fā)而發(fā)光，也可以通過氧化其它物質(zhì)再與發(fā)光試劑發(fā)生化學(xué)氧化反應(yīng)而發(fā)光，因此電化學(xué)發(fā)光可以有不同的發(fā)光歷程，形成多種方式的分析機(jī)理.相對于較為經(jīng)典的化學(xué)發(fā)光分析法，電化學(xué)發(fā)光分析有較為顯著的優(yōu)勢，化學(xué)發(fā)光分析通過試劑混合發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光，因而發(fā)光過程可控性較差，一般主要通過對反應(yīng)試劑流路的控制來實(shí)現(xiàn)對發(fā)光信號的可重復(fù)的測量，但這種流路控制技術(shù)需要有較高的自動化程度和精度，需要較為復(fù)雜和較高成本的儀器設(shè)備，而電化學(xué)發(fā)光分析由于是以電化學(xué)氧化作為發(fā)光的能量源，因此發(fā)光過程可控性好，通過施加電壓的方式來調(diào)節(jié)發(fā)光過程，可以實(shí)現(xiàn)在時間和空間上對發(fā)光過程的控制，測量易于實(shí)施，使用普通形式的電化學(xué)池即可實(shí)現(xiàn)分析目的，其靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等性能都十分優(yōu)越，目前研究工作比較豐富，也已經(jīng)有一定范圍的應(yīng)用，作為一種高靈敏的分析檢測技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于生物體系.由于以魯米諾為發(fā)光試劑的發(fā)光體系在中性介質(zhì)中的ECL較弱，因此尋找更多可靠而實(shí)用的增敏劑很有研究意義.已有文獻(xiàn)報道增敏劑如溶解氧［4］、H2O2［5］、氨基酸［6］及I-［7］等能增強(qiáng)其發(fā)光，并應(yīng)用于一些生物活性分子的檢測［8］.本文將報道牛血清白蛋白(BSA)對魯米諾ECL的增敏作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在pH8.0的緩沖溶液中，牛血清白蛋白對魯米諾的電化學(xué)發(fā)光有較明顯的增敏作用，本研究為探索一種新方法用于測定蛋白質(zhì)提供了可能，也將擴(kuò)大電化學(xué)發(fā)光分析的研究和應(yīng)用范圍.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

魯米諾購自Fluka，牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma.實(shí)驗(yàn)用水均為二次亞沸水，其它試劑均為分析純.

儀器裝置見參考文獻(xiàn)［9］，以數(shù)字脈沖發(fā)生器為信號源，經(jīng)恒電位儀施加于三電極系統(tǒng)，以Pt電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對電極.微弱光測量儀采用光電倍增管測量電化學(xué)發(fā)光信號，負(fù)高壓為800V，光電流經(jīng)放大轉(zhuǎn)換后由數(shù)字化接口傳入計算機(jī)進(jìn)行記錄.

電極預(yù)處理：Pt電極經(jīng)拋光劑拋光、亞沸水清洗即可.

1.2 實(shí)驗(yàn)條件及方法

脈沖幅值1.15V,上限電位0.85V，下限電位-0.3V；脈沖周期2s.

在電化學(xué)發(fā)光池中加入1mL待測溶液，用微量進(jìn)樣器注入20μL 10-4mol/L魯米諾溶液，將電極系統(tǒng)置入其中并施加電壓，用微弱光測量儀檢測光強(qiáng).

1.3 研究內(nèi)容

1.3.1 pH值及牛血清白蛋白濃度對魯米諾電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

文獻(xiàn)表明蛋白質(zhì)在pH=7.4左右時活性最大，pH過大或過小都容易使蛋白質(zhì)失活.而魯米諾的電化學(xué)發(fā)光以在較強(qiáng)的堿性溶液中發(fā)光強(qiáng)度較大，因此測定牛血清白蛋白需要選擇一個合適的化學(xué)環(huán)境，既要使蛋白質(zhì)保持活性，又要使魯米諾有足夠的發(fā)光強(qiáng)度，在pH6.0-10.0的緩沖溶液中測試相同濃度BSA的增敏效益，選取最佳條件.在所選定的最佳pH條件下，測定加入不同濃度BSA時魯米諾ECL強(qiáng)度與BSA濃度之間的關(guān)系，考察BSA對魯米諾ECL的增敏性能.

1.3.2 循環(huán)伏安法研究BSA對魯米諾氧化還原的影響

在電化學(xué)池中加入1mL含魯米諾的磷酸緩沖溶液，用微量注射器加入BSA，將電極置入其中并施加電壓，掃描循環(huán)伏安曲線，并討論兩者之間的相互作用.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA測定條件的選擇

由于溶液酸堿度一方面影響魯米諾的ECL強(qiáng)度，同時又影響B(tài)SA的活性，因此是本研究中最主要考察的影響因素.較高的pH值條件下魯米諾具有較強(qiáng)的ECL，產(chǎn)生很大的測量背景，同時也可能造成BSA的變性而失去其原有的功能；過低的pH值條件下，魯米諾所產(chǎn)生的ECL信號很弱，同樣對測定不利.研究中在pH6.0-10.0范圍內(nèi)，檢測不同pH緩沖溶液中BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏作用，結(jié)果表明在pH=8.0時BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光信號增敏效果最佳，如圖1所示.因此將此pH值的磷酸鹽緩沖溶液作為研究中使用的支持電解質(zhì)溶液.

2.2 BSA濃度與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系

在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，不同濃度BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的影響見圖2.隨著BSA濃度的增加，ECL信號增強(qiáng)，在BSA濃度達(dá)到1.2×10-8g/mL時，ECL達(dá)到信號最強(qiáng).隨后濃度增加信號減弱，這可能是由于BSA為生物大分子，濃度過高時可能會發(fā)生散射，導(dǎo)致ECL強(qiáng)度降低.

2.3 BSA對魯米諾氧化還原行為的影響

圖2 不同濃度BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的影響c(Luminol)=2.0×10-6mol/L

圖4 BSA濃度對魯米諾氧化還原峰電流的影響c(Luminol)=2×10-4mol/L

采用循環(huán)伏安法研究BSA存在時魯米諾的氧化還原行為有助于理解BSA增敏魯米諾ECL的原因，當(dāng)在魯米諾溶液中加入較低濃度BSA時，可以明顯觀察到魯米諾的氧化還原電流增大，其循環(huán)伏安曲線見圖3，但峰電位及形狀未發(fā)生變化，表明其電化學(xué)行為未發(fā)生任何變化，只是氧化還原反應(yīng)發(fā)生的程度有所提高.但隨著BSA濃度的增加，魯米諾的氧化還原峰電流又趨于減小，圖4所示為魯米諾氧化還原峰電流隨BSA濃度的變化.

由圖3、4可以看出，魯米諾的氧化還原峰電流隨著BSA濃度的增加而增加，但當(dāng)加入BSA的濃度過大時，氧化還原峰電流又會逐漸減小.上述實(shí)驗(yàn)盡管在測定中由于靈敏度等因素而選擇使用不同的魯米諾濃度，因此BSA對魯米諾的ECL或CV行為產(chǎn)生影響的濃度上略有差異，但表現(xiàn)出的規(guī)律是一致的，即低濃度BSA的加入無論對魯米諾的電化學(xué)氧化還原還是電化學(xué)發(fā)光都具有明顯的促進(jìn)作用，而當(dāng)BSA濃度較大時，這種促進(jìn)作用逐步減弱.

在上述條件下，在BSA濃度為1.00×10-9～1.20×10-8g/mL的范圍內(nèi)，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和BSA的濃度成線性關(guān)系，線性方程為I=0.87+0.37CBSA，r=0.9941，這為利用魯米諾的ECL測定蛋白質(zhì)提供了一種靈敏的新方法.

3 機(jī)理討論及結(jié)論

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在pH8.0的磷酸緩沖溶液中，BSA對魯米諾的電化學(xué)氧化還原過程表現(xiàn)出了一定程度的促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用并不改變魯米諾的氧化還原機(jī)理，因此可以推測為當(dāng)在魯米諾溶液中加入一定濃度BSA時，魯米諾分子被吸附于BSA表面，同時由于BSA在電極上有一定的吸附性，從而使電極表面對魯米諾發(fā)生一定程度的富集，使魯米諾的電化學(xué)氧化還原得以增強(qiáng)，同時，由于魯米諾的ECL過程是基于魯米諾的氧化激發(fā)，因此電極表面有更多魯米諾發(fā)生氧化時，其激發(fā)態(tài)的數(shù)量也相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致ECL強(qiáng)度的增強(qiáng).而當(dāng)BSA濃度進(jìn)一步增加時，BSA分子間可能發(fā)生聚合，則上述由于吸附引起的對魯米諾的氧化還原的促進(jìn)作用減弱，同時由于BSA聚合體體積增大、數(shù)量增加，溶液的散射程度也會增加，導(dǎo)致所檢測到的ECL強(qiáng)度逐步減小.該研究為測定蛋白質(zhì)提供了一個新方法，同時也擴(kuò)大了電化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用范圍.

[1]尹學(xué)博，楊秀榮，汪爾康.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)/電化學(xué)發(fā)光及其微芯片技術(shù)[J].化學(xué)進(jìn)展，2005，17(2)：181-185.

[2]張成孝，漆紅蘭.電化學(xué)發(fā)光分析研究進(jìn)展[J].世界科技研究與發(fā)展，2004，26(4)：7-13.

[3]混旭，章竹君.納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光傳感器的研究進(jìn)展[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報，2009，37(5)：56-66.

[4]黃炳強(qiáng)，郭文英，徐揚(yáng)，等.溶解氧對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)效應(yīng)研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2003，23(5)：849-851.

[5]Sakura S.Electrochemiluminescence of hydrogen peroxide-luminol at a carbon electrode[J].Anal Chim Acta,1992,262:49-57.

[6]儲海虹，郭文英，狄俊偉，等.半胱氨酸對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏作用[J].分析科學(xué)學(xué)報，2005，21(6)：676-678.

[7]Seitz W R,Hercules D M.Quantitative study of chemiluminescence from the iodine-luminol reaction[J].J Am Chem Soc,1974,26:4094-4098.

[8]Tu Y F,Qi Y Y,Wu Y,et al.Quenching electrochemiluminescential analysis of pico-molar level glutathione[J].Chem J Internet,2003,5(12):97.

[9]屠一鋒，郭文英，黃炳強(qiáng)，等.影響魯米諾體系電致化學(xué)發(fā)光因素的研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2001，18(2)：185-188.