富硒靈芝中硒和多糖含量的測定1)

陳慶榆,孫玉軍,尹鋒

(安徽科技學院生命科學學院,安徽 鳳陽 233100)

靈芝屬于擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬,為多孔菌科真菌赤芝[Ganoderma lucid um(Leyss.ex Fr.)Karst.]或紫芝(Ganoderma sinense Zhao Xu et Zhang)的干燥子實體[1],是我國中藥及傳統(tǒng)食療寶庫中的瑰寶。靈芝含有豐富的營養(yǎng)成分,其中靈芝多糖是最主要的有效成分[2]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究證明,靈芝多糖具有增強機體免疫力、抗自由基、延緩衰老等作用[3]。靈芝還具有很強的富硒能力,所富集的硒主要以蛋白硒、多糖硒、核酸硒等有機態(tài)硒存在。硒是人體必需的微量元素之一,參與人體許多組織的代謝,缺硒會導致多種疾病[4]。無機硒在體內不易吸收且毒性強,人體對有機硒的吸收率比無機硒高30%,毒性也小,并且可以在人體組織內儲存[5]。因此利用靈芝作為富硒的載體,將無機硒轉化為有機硒、發(fā)揮硒和靈芝固有的生理作用,在醫(yī)藥領域具有很廣闊的應用前景。

杜明[6]等對富硒靈芝子實體中的富硒蛋白進行了研究,目前對靈芝富硒多糖的研究也較多,但主要是發(fā)酵液富硒多糖,對子實體富硒多糖的研究相對較少。本文以富硒靈芝子實體為原料提取富硒多糖,對其多糖和硒含量進行測定。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

富硒靈芝子實體:在普通靈芝栽培料中,添加不同量的無機硒鹽(0、50 、100、150、200、250 μg/g 栽培料),通過靈芝菌在生長過程中對無機硒的吸收、富集,然后轉化為含有機態(tài)硒的生物富硒靈芝子實體材料。

1.2 儀器

UV 756MC紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);電子分析天平JA5003(上海天平儀器廠);HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇國勝實驗儀器廠);可調試電熱爐(江蘇金壇國勝實驗儀器廠)

1.3 試劑

Dextran T10,瑞典 Pharmacia公司;鄰苯二胺(AR.)、蒽酮(AR.)、葡萄糖(AR)等,上?；瘜W試劑公司;高氯酸(AR),上海金鹿化工有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

采集富硒靈芝子實體以及普通靈芝子實體,用自來水洗凈,蒸餾水沖淋,切片,冷凍干燥粉碎制成試驗樣品,分別編號為CK 和A 、B、C 、D、E。

2.2 樣品中硒含量的測定

2.2.1 硒標準曲線的繪制[7]。分別取硒標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L 置于 125 m L 分液漏斗中,加入3 m L 0.1%鄰苯二胺溶液,用水稀釋成50 m L左右,搖勻后再用80%甲酸和濃氨水調pH為2,在暗處放置1h,用10m L甲苯萃取振蕩3 min,靜置8 min,將萃取的硒標準溶液轉移至50 m L容量瓶中定容。用1 cm比色皿,以試劑空白為參比,在335 nm處測其吸光度。由測得的吸光度A值與Se濃度繪制標準曲線。

2.2.2 樣品中硒含量的測定。準確稱取2 g試樣置于100 m L燒杯中,加入混合酸(HNO3∶H2SO4∶HClO4=4∶1∶1)15m L,蓋上表面皿,消化 24h,加熱冒白煙至溶液澄清時,冷卻,轉移到50 m L容量瓶中定容。分取試液10.0 m L置于125 m L分液漏斗中,同上處理,測吸光度,計算其相應含量。

2.3 樣品中多糖含量的測定

2.3.1 葡聚糖標準曲線的繪制[8]。

將葡聚糖Dextran T10置于60℃下烘1h,再逐漸升溫至105℃,干燥至恒重。精密稱取 0.100 g,置500m L容量瓶中,用蒸餾水溶解并定容到刻度,精密吸取5.0、10.0、15.0、25.0 、37.5 m L,分別置100m L 容量瓶中 ,用蒸餾水定容至刻度 ,分別得到 10 、20 、30 、50 、75 μg/m L的溶液。再分別取上述試液各1.0 m L,在冰水浴中加入蒽酮-硫酸試劑5.0 m L,放置,冷卻至室溫。以蒸餾水1.0m L加入蒽酮-硫酸試劑5.0 m L為空白對照,于620 nm處測定吸光度。

2.3.2 樣品中多糖的提取。靈芝樣品10g加l m L NaOH溶液l00 m L,60℃水浴中提取4h,抽濾,濾渣加lm L NaOH溶液50 m L,反復提取兩次,合并濾液,濃縮[9],Sevag法除蛋白,加入95%(體積分數(shù))乙醇,4℃靜置過夜,5000r冷凍離心15 min,沉淀冷凍干燥得靈芝硒多糖,加蒸餾水溶解,稀釋至適當濃度,同上處理,測吸光度,計算其相應含量。

3 結果與分析

以硒濃度為橫坐標,A335為縱坐標,繪制硒標準曲線,得回歸方程為C=0.02135A+0.00026。

根據(jù)回歸方程,進一步計算得樣品中的硒元素含量(見表1)。

以葡聚糖濃度為橫坐標,A620為縱坐標,繪制糖標準曲線,得回歸方程為A=0.0091C+0.0411,R2=0.9915。根據(jù)回歸方程,進一步計算得樣品中多糖含量(見表1)。

表1 富硒靈芝硒和多糖的含量

圖1 不同硒鹽濃度對富硒靈芝硒和多糖含量的影響

在培養(yǎng)基中分別添加 0、50、100、150、200、250 μg/g的硒鹽,人工栽培相應獲得普通靈芝子實體(對照CK)以及富硒靈芝子實體A 、B、C 、D、和 E,通過分析其中硒的含量,結果發(fā)現(xiàn):

人工栽培的普通靈芝子實體中硒的含量僅為3.192 μg/g,而富硒靈芝子實體 A 、B、C、D 、E 的硒含量則分別為 28.976、54.032、79.159、86.291 和 90.405 μg/g,在培養(yǎng)基中硒濃度較低(150μg/g)時,靈芝中富集的硒量隨著環(huán)境中添加硒量的增加而顯著增加,但當達到富硒水平79.159μg/g后,靈芝子實體富集硒的能力又開始減弱,高硒抑制了靈芝子實體對硒的進一步吸收和生物轉化。

從表1可以看出,不同含硒量的富硒靈芝子實體中多糖的含量均高于對照普通靈芝,這說明硒影響了靈芝子實體多糖的代謝,促進了多糖的合成。當硒鹽濃度150μg/g時,富硒靈芝中多糖含量為11.456%達到了最大值,即靈芝在一定硒濃度范圍內合成高含量的多糖可能是為了結合更多的硒,并與胡國元[10]在富硒金針菇菌絲多糖研究中的結論一致。但硒對靈芝多糖和硒轉化的影響并不相同,隨著培養(yǎng)基中外施硒鹽濃度的增加,富硒靈芝中有機硒的含量持續(xù)增加。但靈芝中的多糖含量在硒鹽濃度為150μg/g以上是多糖含量呈顯著下降。

4 結論

實驗結果表明在硒鹽濃度150μg/g以內,靈芝子實體內有機硒含量明顯增加,多糖含量呈上升趨勢,但隨著硒鹽濃度的增大,硒富集能力相對減弱,多糖含量呈下降趨勢,多糖合成受阻,進一步證明在靈芝的富硒培養(yǎng)過程中,硒參與了多糖的合成。

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