元蘑單孢雜交育種試驗(yàn)研究1)

張躍新,閆寶松,馬鳳,毛憲偉

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,牡丹江 157011;2.牡丹江市林業(yè)局三道關(guān)林場(chǎng))

元蘑學(xué)名亞側(cè)耳(Hohenbuehelia serotina),是黑龍江省特有的山珍之一。元蘑肉質(zhì)細(xì)膩,柔嫩鮮美,營養(yǎng)價(jià)值極高,經(jīng)常食用具有加強(qiáng)肌體免疫,增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力,益智開心,益氣不饑,延年輕身等作用。近年來,我省元蘑栽培已初具規(guī)模,元蘑已成為我省食用菌的特色產(chǎn)品,產(chǎn)品除我省內(nèi)銷外,在全國各地均有不同的市場(chǎng)需求。但不容忽視的是,我省元蘑產(chǎn)業(yè)還存在著菌種市場(chǎng)混亂、養(yǎng)菌后熟時(shí)間過長、平均產(chǎn)量不高等問題,為了解決這些問題,除了改善生產(chǎn)技術(shù)手段以外,更重要的一點(diǎn)就是改良品種,選育出產(chǎn)量高、后熟時(shí)間短的元蘑優(yōu)良品種。本文通過單孢雜交育種試驗(yàn),選育出了元蘑優(yōu)良品種,為元蘑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 元蘑菌株性狀調(diào)查與優(yōu)良菌株收集

1.1 元蘑生產(chǎn)菌株調(diào)查與采集

我省元蘑主產(chǎn)區(qū)為牡丹江地區(qū)、伊春地區(qū)、尚志市,牡丹江地區(qū)尤以東京城林業(yè)局、大海林林業(yè)局元蘑產(chǎn)業(yè)較為突出。課題組在牡丹江地區(qū)東京城林業(yè)局、大海林林業(yè)局收集元蘑優(yōu)良生產(chǎn)菌株各1個(gè),編號(hào)為“元1” 、“元 2” 。

表1 元蘑主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量性狀調(diào)查表

1.2 野生元蘑品種的采集

課題組深入三道關(guān)林區(qū)進(jìn)行了野生元蘑的采集,共采集野生元蘑品種2個(gè),分別編號(hào)為“元3”、“元4”。其性狀見表2。

表2 野生元蘑性狀調(diào)查表

2 單孢雜交試驗(yàn)

2.1 供試菌株

元 1,元 2,元 3,元 4(見表 1 、表 2)。

2.2 供試培養(yǎng)基

孢子萌發(fā)培養(yǎng)基:馬鈴薯 20g、葡萄糖 20g、瓊脂20g、硫酸鎂 1.5g、磷酸二氫鉀 3g、蛋白胨 5g,水1000mL;

PDA綜合培養(yǎng)基:馬鈴薯20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、硫酸鎂1.5g、磷酸二氫鉀3g,水1000mL。

2.3 水分對(duì)孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

將孢子分為兩組,分別用無菌水稀釋,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)量。第一組稀釋后直接涂布在培養(yǎng)皿上,每個(gè)培養(yǎng)皿涂布100個(gè)孢子,三次重復(fù),暗光25℃培養(yǎng);第二組在 25℃條件下分別浸泡 0、8、16、24、32、40、48 、56、64 、72、80 h,浸泡后分別涂布于培養(yǎng)皿上,每個(gè)培養(yǎng)皿涂布100個(gè)孢子,三次重復(fù),暗光25℃條件下培養(yǎng),計(jì)算孢子萌發(fā)數(shù)。

2.4 單核體菌株的獲得

將孢子用連續(xù)稀釋法稀釋,涂布于培養(yǎng)皿上,經(jīng)暗光25℃條件下培養(yǎng),經(jīng)鏡檢觀察,無鎖狀聯(lián)合即為單孢菌絲。

2.5 單核體配對(duì)雜交

將兩個(gè)不同親本的單核菌絲同時(shí)接種于平板培養(yǎng)基上,相距1.0～1.5cm,培養(yǎng)12d左右,待兩菌絲接觸后,挑取交界處的部分菌絲進(jìn)行鏡檢,如發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合,立即將其轉(zhuǎn)接于新的斜面培養(yǎng)基上。

2.6 營養(yǎng)親和性試驗(yàn)

在斜面培養(yǎng)基的中間接種單孢雜交菌絲體,兩端分別接種親本的菌絲體,菌絲能互相長進(jìn)去,連成一片的說明是同種菌絲,若在相交處形成明顯的黃褐色拮抗線,便說明菌種性質(zhì)不同。只有在斜面上同時(shí)出現(xiàn)兩條拮抗線,才說明雜交成功,產(chǎn)生了新的性狀。

2.7 初篩試驗(yàn)

將元1、元2、元3、元13、元23進(jìn)行3級(jí)種的制作,各做50袋菌種,進(jìn)行初步篩選。

2.8 復(fù)篩試驗(yàn)

將初篩出的元13、元23雜交菌株進(jìn)行袋栽復(fù)篩,連同CK(元1、元 2、元3)各栽300袋。對(duì)比平均產(chǎn)量及菌種成熟時(shí)間,最終篩選出元蘑優(yōu)良新品種。

3 結(jié)果與分析

3.1 水分對(duì)孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

圖1 水分對(duì)孢子萌發(fā)的影響

由圖1可知,孢子不經(jīng)浸水處理在40h以后才有少量萌發(fā),在72h后才大量萌發(fā);孢子經(jīng)浸水處理后,在16h后就有少量萌發(fā),在40h后大量萌發(fā),但超過40h后,孢子的萌發(fā)數(shù)反而下降。因此,元蘑孢子經(jīng)無菌水浸泡40h后萌發(fā)率最高。

3.2 單核體菌株的獲得

挑取單孢萌發(fā)菌絲進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)單核體菌株菌絲體長勢(shì)觀察,篩選出菌絲體生長速度快,長勢(shì)旺盛的單核體菌株作為配對(duì)雜交所用的親本菌株。最終篩選出16個(gè)單核體用于雜交配對(duì)。

3.3 單核體配對(duì)雜交

雜交組合分別為元1×元2共24個(gè)組合,元1×元3共24個(gè)組合、元1×元4共24個(gè)組合、元2×元3共24個(gè)組合、元2×元24共4個(gè)組合、元3×元4共24個(gè)組合,合計(jì)雜交組合144個(gè)。

3.4 拮抗線檢測(cè)

在雜交的144個(gè)組合中共有91個(gè)組合產(chǎn)生拮抗線,元1與元2親緣關(guān)系較遠(yuǎn),元1與元3親緣關(guān)系較近,元1與元4親緣關(guān)系較遠(yuǎn),元2與元3親緣關(guān)系較近,元2與元4親緣關(guān)系較遠(yuǎn),元3與元4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.5 鏡檢鎖狀聯(lián)合標(biāo)記

對(duì)未形成拮抗線的53個(gè)組合鏡檢有無鎖狀聯(lián)合,即說明通過雜交形成了具有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲體,表明雜交親和,共有2個(gè)組合,認(rèn)為是雜交菌株。

3.6 營養(yǎng)親和性鑒定

這2個(gè)雜交菌株中與雙親均存在明顯拮抗現(xiàn)象,接觸處形成埂狀的拮抗線。說明這2個(gè)菌株與雙親均形成拮抗線的雜交菌株的遺傳物質(zhì)發(fā)生了一定的變異,在生長代謝方面可能產(chǎn)生了某些與親本菌株相互有抑制作用的物質(zhì)。拮抗現(xiàn)象表明這些雜交菌株是與雙親不同的菌株。

經(jīng)初步雜交試驗(yàn),獲得雜交品種2個(gè),即元1×元3組合、元2×元3組合的雜交種各1個(gè),分別編號(hào)為元 13、元 23。(見表3)

表3 元蘑雜交結(jié)果

3.7 初篩試驗(yàn)

經(jīng)初篩試驗(yàn),篩選出養(yǎng)菌期后熟時(shí)間短、菌絲長勢(shì)好、菇型較好、產(chǎn)量較高的的雜交菌株元13、元23各2株。

3.8 復(fù)篩試驗(yàn)

3.8.1 雜交菌株復(fù)篩產(chǎn)量分析

表4 雜交菌株復(fù)篩產(chǎn)量分析

雜交菌株復(fù)篩產(chǎn)量分析表明,元23、元13產(chǎn)量顯著高于其親本菌株(CK),元23與元13在產(chǎn)量上無顯著差異。

3.8.2 元蘑復(fù)篩菌絲體成熟時(shí)間顯著性分析

表5 元蘑復(fù)篩菌絲體成熟時(shí)間顯著性分析

由表5可知,元13在菌絲體成熟時(shí)間上與其親本有顯著差異,元23菌絲體成熟時(shí)間較短,但與其親本無顯著差異。因此,元13在菌絲體成熟時(shí)間上明顯優(yōu)于其它菌株。

4 結(jié)論與討論

4.1 復(fù)篩試驗(yàn)表明,在產(chǎn)量方面,雜交品種元 13、元23的產(chǎn)量均比其親本產(chǎn)量顯著提高,產(chǎn)量性狀較好;在菌絲體成熟時(shí)間上,元13菌絲體成熟時(shí)間短,顯著優(yōu)于其它菌株,但元23與其親本無顯著差異。綜合比較,元13的性狀優(yōu)于元23,因此,選定元13為元蘑雜交優(yōu)良品種。

4.2 食用菌雜交育種是食用菌品種選育中應(yīng)用最廣泛、收效最顯著的育種手段,尤其是單孢雜交育種,能獲得菌種更純的雜交品種。但嚴(yán)格意義上來講,單孢雜交育種并沒有經(jīng)過核融合后分子水平上的基因重組,只是一種細(xì)胞水平上的物質(zhì)重組。理論上,雜交后F2代菌株再經(jīng)過單孢雜交就有可能得到核融合菌株,其優(yōu)良性狀可能更多。因此,建議以后做F2代單孢雜交育種試驗(yàn)。

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