酒石酸唑吡坦口溶片的藥動學(xué)及生物等效性研究

徐家根，初立梅，許靜，徐康康（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，南京市210008）

唑吡坦（Zolpidem）屬咪唑吡啶類藥，是新一代鎮(zhèn)靜劑，通過選擇性作用于γ-氨基丁酸（GABA）a受體，增加GABA的傳遞，與ω1受體結(jié)合后，增加GABA對GABAa結(jié)合位點的親和性，從而導(dǎo)致氯離子通道開放，使氯離子流入神經(jīng)細胞內(nèi)，引起細胞膜超極化，抑制神經(jīng)細胞元激動[1]。臨床常用于治療偶發(fā)性、暫時性、慢性失眠癥，口服吸收快，起效迅速，能縮短睡眠潛伏期，減少夜間醒覺次數(shù)，增加總的睡眠時間，提高睡眠質(zhì)量。本研究旨在建立一種快速、靈敏、專屬性強、操作簡便的高效液相色譜-熒光（HPLC-FLU）法，用以測定血漿中唑吡坦?jié)舛?，考察健康志愿者自愿交叉口服受試制劑與參比制劑后，唑吡坦在體內(nèi)的經(jīng)時過程，評價2種制劑的生物等效性，為臨床合理用藥及其新藥報批提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100系列高效液相色譜儀，包括二元高壓泵、在線真空脫氣機、自動進樣器及其溫控系統(tǒng)、半微量池可變紫外檢測器和熒光檢測器、化學(xué)高級色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Agilent公司）；十萬分之一電子天平（瑞士Toledo Mettler公司）；低溫離心機（上?？茖W(xué)儀器廠）；超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

受試制劑：酒石酸唑吡坦口溶片（香港澳美制藥股份有限公司，規(guī)格：每片2.5 mg，批號：081117）；參比制劑：酒石酸吡唑坦片（樂坦，規(guī)格：每片10 mg，湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，批號：080215）；酒石酸吡唑坦標準品（香港澳美制藥股份有限公司，純度：99.8%）；甲醇為色譜純，其它試劑為分析純，試驗用水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-水（含1%醋酸溶液）（40∶60）；檢測波長：激發(fā)波長＝254 nm、發(fā)射波長＝390 nm；柱溫：22 ℃；流速：0.3 mL·min－1；進樣量：2 μL。在該色譜條件下，高效液相色譜圖見圖1。

2.2 試驗對象

18名男性健康受試者，體質(zhì)量（66.2±4.7）kg，年齡（23.3±2.9）歲，均為南京在校大學(xué)生。經(jīng)體檢證明肝、腎功能正常，心電圖正常。試驗前2周及試驗期間未服用其它任何藥物。試驗期間統(tǒng)一飲食。本試驗經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意，受試者試驗前均簽署知情同意書。

2.3 試驗方案

采用隨機自身對照周期交叉試驗設(shè)計，18名男性受試者隨機分成2組，一組先口服受試制劑，另一組口服參比制劑，劑量為7.5、10 mg。服藥方式：志愿者禁食過夜（10 h以上），次日早晨7∶00空腹服藥，服普通片時用溫開水200 mL送服，服口溶片時無需飲水（特殊情況下用10 mL溫水沖服），服藥4 h后統(tǒng)一進標準餐。間隔2周進行交叉試驗。受試者在給藥前均抽取空白血，并于口服受試制劑后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、9 h時，口服參比制劑后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、10 h時采血3 mL于肝素化試管中，分離出血漿，－35℃保存待測。血樣采集在臨床監(jiān)護室中進行，以有經(jīng)驗豐富并經(jīng)過《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》（GCP）培訓(xùn)的醫(yī)護人員進行監(jiān)護，及時記錄試驗期間出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

2.4 血漿樣品處理

精密加入血漿樣品0.2 mL于離心管中，加入甲醇0.7 mL，渦旋3 min，于16 000 r·min－1離心3 min。自動進樣器精密吸取上清液2μL進樣分析。

2.5 標準曲線的制備

所建立的高效液相色譜（HPLC）法，吡唑坦峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)，吡唑坦出峰時間在3.9 min左右。應(yīng)用加權(quán)最小二乘法在2、5、10、20、50、100、300 μg·L－1的標準系列濃度下，按“2.4”項下“加入甲醇0.7 mL”起操作，每種濃度做5份樣品，記錄色譜圖及吡唑坦峰面積。以吡唑坦峰面積平均值（As）對血藥濃度（C）作回歸計算，得回歸方程：As＝0.196 75C+0.013 24（r＝0.999 5，權(quán)重系數(shù)W＝1/C*C）。定量下限濃度為2 μg·L－1。

2.6 回收率及精密度試驗

取離心管數(shù)支，分別取吡唑坦標準液適量于離心管中，用甲醇配成含吡唑坦?jié)舛确謩e為5、20、100 μg·L－1的溶液，每份0.5 mL，以氮氣流吹干后，精密加入雙重蒸餾水0.2 mL和甲醇0.7 mL溶解殘渣，離心后精密吸取2 μL進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積As。另取離心管數(shù)支，于離心管中精密加入不同量的吡唑坦標準液適量，以氮氣流吹干后，精密加入空白血漿0.2 mL，渦旋15 s，配成含吡唑坦?jié)舛确謩e為5、20、100 μg·L－1的含藥血漿，每種濃度各做5份樣品，加入甲醇0.7 mL，渦旋3 min，于16 000 r·min－1離心3 min，精密吸取2 μL上清液進樣分析。記錄色譜圖，計峰面積Ai，上述Ai和As的比值即為唑吡坦的絕對回收率（R），即R＝Ai/As×100%。另取離心管數(shù)支，于離心管中精密加入不同量的吡唑坦標準液適量，以氮氣流吹干后，精密加入空白血漿0.2 mL，渦旋15 s，配成含吡唑坦?jié)舛确謩e為5、20、100 μg·L－1的含藥血漿，按“2.4”項下“加入甲醇0.7 mL”起操作，每種濃度各做15份樣品（3 d 3批次），記錄色譜圖，記下峰面積（A）代入相應(yīng)標準曲線，計算求得日內(nèi)與日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery and precision test（±s ，n＝3）

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery and precision test（±s ，n＝3）

加入濃度/μg·L-1 5 20 100日間RSD/%4.8 3.4 2.8絕對回收率/%92.8±1.6 90.5±1.4 93.6±0.5相對回收率/%95.3±3.2 101.1±1.9 98.6±1.0日內(nèi)RSD/%3.3 2.9 2.1

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗

取干凈離心管數(shù)支，按“2.5”項下方法制備含唑吡坦?jié)舛确謩e為5、20、100 μg·L－1的標準含藥血漿，平行制備5份，一份配制好后按“2.4”項下方法處理，立即進樣分析；一份沉淀后4℃放置4 h同法操作；一份室溫放置6 h后同法操作；一份配置好后置冰箱中冷凍保存21 d后取出解凍；另一份在21 d內(nèi)反復(fù)凍融3次，然后同法操作。各濃度樣本測定值與加入濃度的RSD均＜10%，表明樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性考察結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 2 Results of stability test

方法學(xué)驗證結(jié)果表明，本方法符合《藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則》生物樣品分析要求。本方法特異性強、靈敏度高，適用于唑吡坦的藥動學(xué)和生物等效性研究，3個濃度的質(zhì)控樣品與受試者血樣同步測定，其RSD均＜10%。

2.8 數(shù)據(jù)處理與生物等效性評價方法

志愿者的藥-時數(shù)據(jù)，經(jīng)BAPP2.3軟件處理，用非房室模型法估算藥動學(xué)參數(shù)，達峰濃度（Cmax）和達峰時間（tmax）采用實測值，藥-時曲線下面積（AUC）用梯形面積法求得（AUC0～τ和AUC0～∞）。受試制劑的相對生物利用度計算公式為F＝AUC0～τ（受試制劑）/AUC0～τ（參比制劑）×100%；t1/2＝0.693/λz，λz為末端相消除速率常數(shù)。對受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)進行方差分析、雙單側(cè)t檢驗，考察2種制劑是否具有生物等效性。

2.9 藥-時曲線

18名健康志愿者交叉口服酒石酸唑吡坦口溶片7.5 mg和酒石酸吡唑坦片10 mg后，用HPLC-FLU法分別測定各時間點血漿中唑吡坦的濃度，平均藥-時曲線見圖2。

2.10 主要藥動學(xué)參數(shù)

18名健康志愿者單劑量口服酒石酸唑吡坦口溶片7.5 mg和酒石酸吡唑坦片10 mg后，用非房室模型估算其主要藥動學(xué)參數(shù)，見表3。

表3 18名健康志愿者單劑量口服酒石酸吡唑坦受試制劑與參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of zolpidem in 18 healthy volunteers after single oral dose of 2 preparations of zolpidem tartrate

2.11 生物等效性評價

參數(shù)Cmax自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后方差分析和雙單側(cè)t檢驗結(jié)果：90%可信區(qū)間為87.11%～105.18%，P＞0.05，生物等效；AUC0～τ自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后方差分析和統(tǒng)計分析結(jié)果：90%可信區(qū)間為89.98%～101.56%，P＞0.05，生物等效；tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗（Kruskal and Wallis法），P＝0.000 044 3＜0.05。結(jié)果表明，2種制劑吸收程度等效而吸收速度不等效。

3 討論

酒石酸唑吡坦口溶片旨在利用制劑學(xué)的手段，使制劑在口腔中少量唾液存在時即可迅速溶解而吞咽，使藥物在胃中迅速吸收以立即產(chǎn)生藥效，同時可增加口服的便利性，但口服后血漿中唑吡坦的濃度較低，且唑吡坦的紫外吸收特征不明顯，檢測相對比較困難。文獻采用毛細管區(qū)帶電泳（CZE）法[2]或高效液相-紫外（HPLC-UV）法[3]，定量下限均為25 mg·L－1，靈敏度較低，適合唑吡坦相關(guān)制劑的質(zhì)量控制，但難以滿足其生物樣本的分析要求；文獻[4]采用液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法，靈敏度雖得到提高，但試驗成本高，儀器普及率低；文獻[5，6]采用HPLC-FLU法，磷酸緩沖液作為水相，但該方法色譜柱平衡時間較長，樣品保留時間較長，流動相構(gòu)成比復(fù)雜，不易重現(xiàn)，且血漿樣品處理分別采用固相萃取柱處理和有機溶劑提取，樣品處理成本高，過程復(fù)雜，系統(tǒng)誤差大，對操作者毒性大。

本試驗建立的方法選擇甲醇-1%醋酸溶液（40∶60）作流動相，流動相構(gòu)成比簡單，在此條件下，目標化合物峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)，保留時間適宜，適合大樣本量的測試。同時筆者采用了內(nèi)徑小的短柱（150 mm×3 mm，3.5 μm），低流速（0.3 mL·min－1）和小進樣體積（2 μL），大大縮短了樣品的分析時間，流動相用量少，柱壽命延長，儀器損耗減少。樣品處理采取甲醇沉淀蛋白法，操作簡單、快速、系統(tǒng)誤差小，避免了其他方法的有機溶劑毒性和復(fù)雜的操作過程，同時也降低了試驗成本。

試驗結(jié)果表明，18名健康志愿者交叉口服酒石酸唑吡坦口溶片7.5 mg和酒石酸吡唑坦片10 mg后，2種制劑吸收程度等效而吸收速度不等效，原因是受試制劑為口溶片，吸收速度快于參比制劑（普通片）。筆者通過預(yù)試驗對2種制劑的血樣采集時間作了適當(dāng)調(diào)整。在整個研究期間，18名健康志愿者中無一例因不良反應(yīng)而終止試驗，其血液、血液生化、尿常規(guī)以及心電圖檢查在試驗前、后未見異常，說明本品在試驗劑量下表現(xiàn)出良好的安全性。

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