穿心蓮內(nèi)酯對(duì)巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶2及其產(chǎn)物表達(dá)的影響

李 明 陳偉強(qiáng) 李 巖*

1 廣東省廣州市藥學(xué)院病理生理學(xué)教研室（510006）

2 廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)教研室（510006）

前列腺素（prostaglandins，PGs）是一種與炎癥緊密相關(guān)的重要介質(zhì)，環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）為PGs生物合成的重要限速酶。COX存在兩種異構(gòu)體，其中COX-2為誘導(dǎo)酶，通常不表達(dá)或低表達(dá)，在遇到外界刺激如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、致癌基因等時(shí)可在巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中高表達(dá)，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)[1]。越來越多的證據(jù)表明，COX-2與炎癥性疾病的關(guān)系非常密切，在多種炎癥疾病和動(dòng)物炎癥模型的炎性滲出液中均發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，抑制COX-2可有效減輕炎癥損傷[2,3]。

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮屬植物穿心蓮干燥地上部分，作為常用中藥，具有清熱解毒、涼血消腫等功效。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要藥效成分，有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯有顯著的抗炎活性，對(duì)大鼠蛋清蛋白、角叉菜膠足趾注射致炎模型均有明顯的抗炎作用[4]。本研究從對(duì)COX-2及其產(chǎn)物PGE2表達(dá)的影響角度出發(fā)，探討穿心蓮內(nèi)酯抗炎活性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

穿心蓮內(nèi)酯（四川廣漢市維康植化有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS，美國Sigma公司）；PGE2Elisa檢測試劑盒（美國R&D公司）；蛋白提取試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）；抗COX-2和β-actin抗體（美國Santa Cruze公司）。蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)實(shí)驗(yàn)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞為由本室保存。用DMEM培養(yǎng)基（含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素) 5 %CO2，37℃條件下傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，0.25%胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，每孔1mL接種到24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長至80%融合后，加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯（終濃度分別為1、10、50μmol/L）孵育1h，然后加入LPS（終濃度1μg/mL）進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常對(duì)照組、穿心蓮內(nèi)酯組、LPS組和穿心蓮內(nèi)酯加LPS組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞或培養(yǎng)上清進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。

1.3 PGE2濃度測定

細(xì)胞加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)18h，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PGE2Elisa試劑盒檢測上清液中PGE2的含量。操作步驟按試劑盒說明書完成。

1. 4 COX-2蛋白表達(dá)水平的測定

細(xì)胞加入LPS后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用冰冷的PBS終止刺激，按說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50μg樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（5 %的濃縮膠和10 %的分離膠），轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1h，加抗COX-2或抗β-actin一抗(1∶1000) 4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶2000)，37℃下孵育1h，ECL法顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PGE2生成的影響

PGE2Elisa檢測結(jié)果顯示，在正常情況下巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)上清中PGE2含量極低，用100μmol/L濃度的穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用，對(duì)PGE2的生成無明顯影響，與空白對(duì)照組比較P＞0.05。1μg/mL LPS刺激可以顯著促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的PGE2合成，與空白對(duì)照組比較P＜0.01。穿心蓮內(nèi)酯可在1～50μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的PGE2生成，與LPS組比較有顯著性差異。結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PGE2分泌的影響 （±s，n=6）

表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PGE2分泌的影響 （±s，n=6）

與對(duì)照組比較，a)P＜0.01；與LPS組比較，b)P＜0.05，c)P＜0.01

分組 PGE2（pg/mL）正常對(duì)照組 45.67±15.12穿心蓮內(nèi)酯組 42.33±23.44 LPS組 331.17±38.18a LPS+1μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組 280.00±33.62b LPS+10μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組 241.33±40.89c LPS+50μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組 210.17±31.63c

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)COX-2表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，在正常情況下巨噬細(xì)胞COX-2表達(dá)很低，50μmol/L穿心蓮內(nèi)酯對(duì)COX-2表達(dá)無明顯影響。當(dāng)用LPS刺激后，巨噬細(xì)胞COX-2 蛋白表達(dá)明顯增高。穿心蓮內(nèi)酯可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞COX-2表達(dá)，各處理組COX-2表達(dá)水平明顯低于LPS組，結(jié)果見圖1。上述結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯抑制巨噬細(xì)胞PGE2生成與其抑制COX-2表達(dá)有關(guān)。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞COX-2表達(dá)

3 討 論

PGs是一種與炎癥緊密相關(guān)的重要介質(zhì)，COX為PGs生物合成的重要限速酶。COX存在兩種異構(gòu)體，分別是COX-1和COX-2。COX-1為正常表達(dá)酶，介導(dǎo)細(xì)胞的正常生理功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理平衡與穩(wěn)定；COX-2為誘導(dǎo)酶，靜息狀態(tài)下正常組織中無表達(dá)或弱表達(dá)，當(dāng)受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素刺激時(shí)則迅速合成，表達(dá)增強(qiáng)[1]。在炎性腸病患者的腸道上皮細(xì)胞、慢性支氣管炎大鼠的肺組織和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的斑塊局部就發(fā)現(xiàn)COX-2 的高表達(dá)，同時(shí)伴隨代謝物水平PGE2濃度增加，而抑制COX-2能有效改善病變程度[2,3]，說明COX-2與炎癥性疾病的關(guān)系非常密切。目前臨床上最常用的抗炎、鎮(zhèn)痛藥物之一的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥物就是通過抑制COX-2的活性來發(fā)揮抗炎作用的。但NSAID存在腎臟毒性及消化道不良反應(yīng)，在一定程度上限制了其應(yīng)用[5]。而正在研究開發(fā)特異性COX-2抑制劑（celecoxib、rofecoxib等），雖然降低了不良反應(yīng)發(fā)生率，但其安全性仍有待進(jìn)一步研究和探討。

國內(nèi)外學(xué)者在對(duì)傳統(tǒng)中藥研究中發(fā)現(xiàn)，很多具有良好抗炎作用的中藥可通過直接抑制COX-2的活性或抑制COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)等方面來干擾其功能，影響PGs的合成來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[6,7]。清熱解毒類藥物穿心蓮具有清熱解毒、涼血消腫等功效，是常用的傳統(tǒng)抗炎中藥之一。穿心蓮內(nèi)酯為其主要藥效成分，在大鼠炎癥模型上表現(xiàn)出明顯的抗炎活性。穿心蓮內(nèi)酯是否通過抑制COX-2的表達(dá)及其產(chǎn)物PGE2的生產(chǎn)來發(fā)揮抗炎效應(yīng)呢？我們首先用LPS刺激巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS可以刺激巨噬細(xì)胞COX-2和PGE2的高表達(dá)，然后用Western Blot法檢測穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能有效抑制COX-2的表達(dá)；用Elisa法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中COX-2主要產(chǎn)物PGE2含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯處理后，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PGE2含量明顯下降。根據(jù)這些結(jié)果，我們認(rèn)為穿心蓮內(nèi)酯通過抑制COX-2表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性因子PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。本研究為穿心蓮內(nèi)酯抗炎作用的闡明和穿心蓮內(nèi)酯的進(jìn)一步應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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