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    Caveolin-1在大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用*

    2010-08-02 13:04:38王留東趙二義文全慶關(guān)文娟魯晶晶張博愛賈延劼
    中國病理生理雜志 2010年7期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞干細(xì)胞分化

    王留東,趙二義,文全慶,關(guān)文娟,魯晶晶,彭 濤,張博愛,賈延劼

    (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

    骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞,在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域有十分廣闊的應(yīng)用前景[1]。雖然可以采用多種方法誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞,但其分化機(jī)制尚不清楚。隨著膜細(xì)胞化學(xué)研究的深入,很多報道發(fā)現(xiàn),細(xì)胞膜上的特殊結(jié)構(gòu)-脂筏(lipid raft)在干細(xì)胞生長、分化中起到重要作用[2,3]。本研究以脂筏的標(biāo)記蛋白 caveolin-1為參照,結(jié)合RNA干擾技術(shù),通過觀察caveolin-1在大鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化,初步探討脂筏在MSCs分化中的作用。

    材料和方法

    1 動物

    SPF級成年Wistar大鼠,8-12周,體重200-300 g,由河南省實驗動物中心提供。常規(guī)從大鼠股骨中分離提取MSCs,連續(xù)傳10代以上的細(xì)胞置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

    2 主要試劑

    DMEM液體培養(yǎng)基、B27、胎牛血清購自Gibco;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)購自 PeproTechEc;caveolin -1、神經(jīng)元烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)、神經(jīng)微絲亞單位(neurofilament subunit,NF - M)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz;FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;大鼠Rn-caveolin-1-siRNA、陰性對照siRNA(Cy3標(biāo)記)、陽性對照Rn-MAPK1(mitogen activated protein kinase 1)control siRNA、轉(zhuǎn)染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、Qiagen? OneStep RT-PCR試劑盒均為 Qiagen產(chǎn)品;β-巰基乙醇、噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海生物工程公司根據(jù)設(shè)計合成,見表1。

    表1 引物序列Table1.Primer sequence

    3 主要方法

    3.1 實驗分組 取培養(yǎng)第10代以上的MSCs復(fù)蘇,按照2×106cells/well的比例接種于12孔培養(yǎng)板,置于37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞融合率為50%-70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗根據(jù)轉(zhuǎn)染的不同,選擇同時點的MSCs分為4組,即正常對照組(未轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染 Rn-caveolin-1-siRNA)、陽性對照組(轉(zhuǎn)染Rn-MAPK-1 control siRNA)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative control siRNA)。

    3.2 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染 按照Qiagen公司的實驗說明操作。在每孔加入1.1 mL培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基,10%胎牛血清,雙抗),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。同時,分別將300 ng siRNA(Rn-caveolin-1-siRNA、Rn-MAPK1 control siRNA、negative control siRNA)溶于100 μL DMEM 培養(yǎng)基,再加入6.0 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑,混勻;室溫孵育10 min后;將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入含MSCs孔內(nèi),使siRNA的終濃度達(dá)到20 mol/L,孵育24-72 h。正常對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,其它培養(yǎng)條件同各轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察陰性對照negative control siRNA轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h觀察 MSCs熒光表達(dá)情況,評價細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

    3.3 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞 參照我們的方法[4],取各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實驗。D-Hanks液清洗3次,加入預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基,10%胎牛血清,10 μg/L bFGF)培養(yǎng)24 h。預(yù)誘導(dǎo)后,加入誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基,200-400μmol/L β-巰基乙醇)誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)后加入維持液(DMEM培養(yǎng)基,200-400 μmol/L β - 巰基乙醇,10 μg/L bFGF,B27)繼續(xù)維持6 d。

    3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后,迅速經(jīng)4%多聚甲醛固定液4℃固定20 min,0.2%Triton X -100處理10 min,并用 10%牛血清白蛋白封閉1 h。然后分別用caveolin-1抗體(2.0 mg/L)、NSE 抗體(1.0 mg/L)、NF - M(1.0 mg/L)、GFAP(1.0 mg/L)4 ℃孵育 24 h。用 PBS 洗3遍后,用FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。細(xì)胞圖像通過顯微鏡用10×或20×攝取,圖像均采用300 dpi分辨率。每組獨立的實驗都會采集超過20個區(qū)域的細(xì)胞。而且,在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目。采用雙人雙盲隨機(jī)記數(shù)陽性細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞百分比例。

    3.5 RT-PCR法 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA,分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT-PCR試劑盒實驗操作說明進(jìn)行RT-PCR,總反應(yīng)體積50 μL,其中5×Qiagen OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL,dNTP mix 2.0 μL,Qiagen OneStep RT - PCR enzyme mix 2.0 μL,5 × Q - solution 10.0 μL,RNase inhibitor 10 U,RNA1.0 μg,引物 0.6μmol/L。擴(kuò)增條件為:50℃ 30 min,95℃ 15 min,94℃1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30-35個循環(huán),72℃10 min。然后,取RT-PCR 產(chǎn)物10.0 μL,加上樣緩沖液2.0 μL,在2%瓊脂糖凝膠上電泳,70 V 40 min,凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實驗結(jié)果,凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer Version 3.0)分析各目的基因與β-actin基因條帶吸光度值。

    3.6 細(xì)胞存活率檢測(MTT法) 采取四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法,按照轉(zhuǎn)染前、后各個相同時點,將各組的MSCs轉(zhuǎn)至96孔板,加MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,離心棄上清,再加入二甲基亞砜200 μL,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,選擇490 nm波長,采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值,評價各組細(xì)胞存活率。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    所有的圖形由ImagePro Plus 6.0軟件采集和處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用Graph-Pad Prism 5.01作圖,并根據(jù)不同要求進(jìn)行方差分析和χ2檢驗。

    結(jié) 果

    1 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染

    本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)變化不顯著,僅見少數(shù)細(xì)胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。采用Cy3標(biāo)記的陰性對照(negative control)siRNA評估,大鼠 MSCs 24 h、48 h、72 h 的轉(zhuǎn)染率分別為(50.5 ±5.2)%、(70.5 ±6.5)% 和(81.5 ± 2.8)%,見圖 1。進(jìn)一步采用RT-PCR驗證,正常對照組MSCs可以表達(dá)caveolin-1mRNA、MAPK1 mRNA,轉(zhuǎn)染組 MSCs表達(dá)caveolin-1mRNA顯著降低(P<0.01),陽性對照組MAPK1 mRNA表達(dá)也顯著減弱(P<0.01),而陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組間差異無顯著,見表2。此外,轉(zhuǎn)染前、后各組MSCs的MTT結(jié)果無顯著差異(P>0.05),見表3。

    2 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞

    Figure1.Cy3 labeled negative control group:72 h after negative control siRNA transfection(×200).A:inverted microscope;B:fluorescence microscope.圖1 Cy3標(biāo)記的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染72 h

    表2 RT-PCR結(jié)果Table2.The effect of RT-PCR(%..n=12)

    表2 RT-PCR結(jié)果Table2.The effect of RT-PCR(%..n=12)

    **P <0.01 vs other groups.

    Group Caveolin-1mRNA MAPK1 mRNA Non - transfection 0.677 ±0.023 0.908 ±0.025 Transfection 0.218 ±0.028** 0.865 ±0.035 Positive control 0.702 ±0.048 0.306 ±0.042**Negative control 0.698 ±0.040 0.868 ±0.015

    表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

    表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

    Group Before induction 24 h after induction 72h after induction Non-transfection 0.750 ±0.036 0.745 ±0.020 0.740 ±0.026 Transfection 0.747 ±0.048 0.720 ±0.032 0.715 ±0.028 Positive control 0.738 ±0.023 0.712 ±0.022 0.728 ±0.032 Negative control 0.736 ±0.024 0.710 ±0.031 0.726 ±0.022

    正常對照組誘導(dǎo)6 d,多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞改變,胞體呈多角形或圓形,周圍有光暈,突起細(xì)長,有數(shù)個分支,部分細(xì)胞在局部形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)染Rncaveolin-1-siRNA組誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化更加顯著,誘導(dǎo)24 h,部分細(xì)胞向具有神經(jīng)細(xì)胞特點的細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞體逐漸變成圓形或錐形,折光性增強(qiáng),胞體周圍有較強(qiáng)的光暈,胞體伸展的突起繼續(xù)延長,局部區(qū)域相互交織成網(wǎng),誘導(dǎo)6 d,形成具有典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),見圖2。陽性和陰性對照組形態(tài)學(xué)變化與正常對照組類似。

    Figure2.MSCs of Rn-caveolin-1-siRNA group were induced into neurons(6 h after induction,×200).圖2 Rn-caveolin-1-siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化

    本研究選擇NSE、NF-M和GFAP蛋白鑒定分化后細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前MSCs不表達(dá)上述蛋白。誘導(dǎo)6 d,各組均程度不等表達(dá)NSE和NF-M。其中,轉(zhuǎn)(77.84±3.58)%,顯著的高于其它各組P<0.05,見圖3。但是各組GFAP表達(dá)率均小于5%,無顯著差異,見表4。

    3 Caveolin-1的表達(dá)變化

    誘導(dǎo)前,正常對照組大鼠MSCs的細(xì)胞膜上可以表達(dá)caveolin-1。誘導(dǎo)6 h,caveolin-1開始表達(dá)增強(qiáng),與誘導(dǎo)前相比差異顯著(P<0.05);而且隨時間延長表達(dá)持續(xù)增加,峰值在誘導(dǎo)6 d,與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比差異顯著(P<0.01)。陽性對照組和陰性對照組也有類似的結(jié)果,見表5。

    Figure3.MSCs of Rn-caveolin-1-siRNA group were induced into neurons(6 h after induction,×200).The result observed under inverted microscope(A)and expression of NF-M observed under fluorescence microscope(B).圖3 Rn-caveolin-1-siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化及NF-M表達(dá)

    表4 誘導(dǎo)6 d各組細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

    表4 誘導(dǎo)6 d各組細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

    **P <0.01 vs other groups.

    Group NSE NF-M GFAP Non - transfection 62.90 ±3.71 63.77 ±3.80 2.4±0.900 ±0.85 Transfection 81.49 ±3.07** 77.84 ±3.58** 2.60 ±0.84 Positive control 64.18 ±3.92 59.21 ±3.93 2.82 ±0.91 Negative control 63.84 ±2.71 59.56 ±4.04 3.07

    Rn-caveolin-1-siRNA轉(zhuǎn)染后,MSCs細(xì)胞膜上的 caveolin-1表達(dá)顯著降低,僅為(28.53±5.00)%。誘導(dǎo)6 h,caveolin-1的表達(dá)也有增強(qiáng)的趨勢,但是與誘導(dǎo)前相比無顯著差異(P>0.05);同樣誘導(dǎo)6 d時,caveolin-1的表達(dá)顯著增加,達(dá)到(33.84±5.91)%,與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比顯著差異,P<0.05,見圖4。此外,Rn-caveolin-1-siRNA轉(zhuǎn)染后與其它各組同時點的caveolin-1表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。

    表5 各組細(xì)胞caveolin-1免疫化學(xué)染色結(jié)果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin-1(%..n=6×103cells)

    表5 各組細(xì)胞caveolin-1免疫化學(xué)染色結(jié)果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin-1(%..n=6×103cells)

    #P <0.05 vs 6 d after induction;**P <0.01 vs other groups.

    Group Before induction 6 d after induction Non -transfection 69.27 ±6.09# 74.11 ±4.59#6 h after induction 78.55 ±3.04 Transfection 28.53 ±5.00#** 30.21 ±2.50#** 33.84 ±5.91**Positive control 68.68 ±5.24# 73.60 ±3.65# 78.51 ±3.15 Negative control 69.05 ±4.33# 74.09 ±4.50#79.46 ±3.21

    Figure4.MSCs of Rn-caveolin-1-siRNA group were induced into neurons(6 h after induction,×400).The result observed under inverted microscope(A)and expression of caveolin-1 observed under fluorescence microscope(B).圖4 Rn-caveolin-1-siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化及caveolin-1表達(dá)

    討 論

    體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞是一個復(fù)雜的多信號、多通路的過程,其機(jī)制尚不清楚[5-7]。雖然很多誘導(dǎo)劑(如β-巰基乙醇、神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥等)可以通過不同的途徑激活不同的信號通路,但是幾乎所有的誘導(dǎo)劑作用起點都是細(xì)胞膜。因此,探索MSCs體外誘導(dǎo)過程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化,有助于對其分化機(jī)制的理解。

    目前認(rèn)為,細(xì)胞膜表面存在一種特殊的結(jié)構(gòu)-脂筏,參與轉(zhuǎn)運、內(nèi)吞、內(nèi)化、鈣的動態(tài)平衡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列細(xì)胞過程[2,8]。在脂筏中,有一種特殊類型的脂筏-小凹(caveolae),主要存在于上皮和內(nèi)皮細(xì)胞膜上的許多小的瓶狀內(nèi)陷結(jié)構(gòu),其胞質(zhì)面由一層膜外衣覆蓋,這層外衣的主要成分是小凹蛋白(caveolin)家族,分子量為21-25 kD,屬整合蛋白,其中caveolin-1是分離膜上特化區(qū)域的標(biāo)記蛋白,也是脂筏的重要標(biāo)記蛋白之一[9]。本研究結(jié)果提示,大鼠MSCs可以表達(dá) caveolin -1,與 Park 的結(jié)果類似[10]。

    越來越多的研究發(fā)現(xiàn),caveolin-1在干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮樞紐作用,多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號分子均集中于此。如caveolin-1可以與galectin-1、表皮生長因子等相互作用,通過 Src、Eras、Akt和mTOR等信號通路,影響胚胎干細(xì)胞的增殖和遷移[11,12]。如果基因敲除了 caveolin -1,可以促進(jìn)小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn),caveolin-1在體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的過程中起到兩方面作用:(1)作為一個通用的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,抑制許多信號通路的基礎(chǔ)活性,如Notch通路、胰島素樣生長因子1受體通路[14,15]。Notch通路是一個多步驟、多因素參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4],caveolin-1可以整合 β1-integrin、Notch-1、酪氨酸激酶受體通路的相互作用。β1-integrin能通過 caveolin-1影響Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的轉(zhuǎn)運,進(jìn)而影響Notch-1信號通路;而且,在這種協(xié)同作用下,兩者調(diào)控表皮生長因子受體通路(另一條重要的神經(jīng)細(xì)胞分化通路),實現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞分化的精細(xì)調(diào)節(jié)[15,16]。本研究采用RNA干擾技術(shù),下調(diào)caveolin-1的表達(dá),神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白NSE、NF-M的表達(dá)顯著增加,促進(jìn)了MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化,可能與此有關(guān)。(2)caveolin-1并不單純是一個信號分子的抑制劑,其對某些信號過程中也可起促進(jìn)作用[17]。如本研究發(fā)現(xiàn),無論是否轉(zhuǎn)染Rn-caveolin-1-siRNA,隨誘導(dǎo)時間的延長caveolin-1的表達(dá)持續(xù)增加,當(dāng)誘導(dǎo)6 d時達(dá)到峰值,與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比,均有顯著差異,揭示了caveolin-1表達(dá)變化在此過程中的復(fù)雜性。

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