免疫活化血小板對人臍靜脈內皮細胞 COX－2及PPAR－α表達與活性的影響及LDL的作用*

吳延慶，程曉曙，柴俊兵

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心內科，江西 南昌 330006)

心血管疾病已成為人類的頭號殺手，也是人類致殘的主要原因之一。低密度脂蛋白(low－density lipoprotein cholesterol，LDL)被認為是(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展的基礎因素，LDL在引發(fā)起始的炎癥反應直至血栓形成的過程中都起到了至關重要的作用，LDL的水平越高，冠心病的危險性就越大。降低LDL能夠阻止或延緩AS進展。

血小板在機體內起著重要的促凝血作用。以往認為血小板本身并不主動參與免疫炎癥反應。近年來發(fā)現(xiàn)血小板表面含有不同結構和功能的糖蛋白受體和相應的配體，在血小板不同的狀態(tài)，膜上可表達不同的受體蛋白，血小板一旦被活化，表面就會出現(xiàn)許多新的標志物和促進許多標志物表達增加，其中一些標志物如整合素 αIIbβ3(PAC－1)、CD40L、P－選擇素等與血小板參與免疫炎癥反應密切相關。我們稱之為血小板免疫活化。有學者在研究白細胞與血小板相互作用時發(fā)現(xiàn)，血小板微粒可與中性粒細胞結合，并可在2個中性粒細胞之間充當連接體，使中性粒細胞連接成串珠狀。連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)作為免疫球蛋白超家族中的一員，參與了許多免疫炎癥反應過程，也被發(fā)現(xiàn)在血小板膜表面表達。血小板通過JAMs與白細胞和內皮細胞結合后，可使它們激活并募集中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞聚集，促進炎癥反應。

血管內皮細胞的損傷或功能障礙很可能就是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)或發(fā)展的推動因素。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多內皮細胞的基因表達與AS的發(fā)生與發(fā)展有關。如過氧化物酶體增殖物活化受體 α (peroxisome proliferator activated receptor α，PPAR－α)在AS損傷區(qū)有表達。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX－2)也參與了AS的發(fā)展，在AS的損傷區(qū)存在COX－2的表達，多數(shù)研究認為COX－2在調節(jié)AS穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用，COX－2在AS早期是致炎和促進AS發(fā)生和發(fā)展的。

基于LDL－C在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用及存在的爭議，近來隨著有關血小板在免疫學和炎癥方面功能的新發(fā)現(xiàn)以及血管內皮細胞上諸多與AS相關基因的發(fā)現(xiàn)與研究的深入，盡管近來血小板免疫活化改變在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中有少量研究報道，但缺乏LDL與免疫活化血小板對血管內皮細胞AS相關基因表達的影響及他汀類藥物對血小板免疫活化功能的直接影響的相關報道。因此本研究旨在觀察血小板免疫活化對血管內皮細胞內與AS有關基因PPAR－α、COX－2表達的影響及LDL對這一過程的作用。

材料和方法

1 細胞

新鮮機采去白細胞血小板由省血液中心提供，人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自中南大學湘雅中心實驗室。

2 主要試劑

Ⅰ抗羊抗人COX－2抗體、羊抗人PPAR－α抗體購自Santa Cruz，各種Ⅱ抗購自中杉金橋生物(進口分裝)，Trizol購自Invitrogen，LDL購自Chemicon，0.2 mmol/L ADP購自 Biopool，RT－PCR試劑盒及Random primers購自Promega，蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，PPAR－α活性測定試劑盒購自Caymen，PGE2ELISA試劑盒購自Amersham，COX－2、PPAR－α及GAPDH引物購自上海生工公司。

3 血小板保存培養(yǎng)及與HUVECs共孵育

從血液中心購取機采血小板，用白細胞過濾器進行進一步白細胞過濾，并進行血小板計數(shù)及白細胞、紅細胞含量測定(方法同前)，用血小板專用保存袋在血小板振蕩保存機中22℃水平振蕩條件下保存。實驗前用22℃ PBS液洗滌，22℃、4000×g離心10 min，反復2次后，調整細胞濃度至2×1010cells/L，用 RPMI－1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中短時間與HUVECs共孵育。

4 血小板活化方法

血小板在腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)的作用下激活，血小板激活復合物1(platelet activating compound 1，PAC －1)和 CD40配體(CD40 ligand，CD40L)的表達增加，因血小板CD40L廣泛參與了免疫炎癥反應，稱之為免疫活化，為達到較多血小板活化數(shù)量，本研究采用了終濃度為5 μmol/L ADP活化血小板。

5 檢測指標及方法

5.1 血小板與HUVECs共孵育后血小板回收及計數(shù) 血小板與HUVECs共孵育后，在超凈臺中首先用吸管小心吸盡懸浮細胞和血小板，然后再用22℃的PBS液輕輕沖洗細胞培養(yǎng)孔，并進一步回收其中的血小板，反復3次，最后進行貼壁 HUVECs的回收、RNA及蛋白的提取。并進行回收血小板的計數(shù)，計算血小板的回收率。

5.2 引物序列 根據(jù) NCBI中的GenBank查得人COX －2、PPAR － α、CD40、GAPDH 基因序列，再用Primer 5.0軟件設計、篩選，其具體序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列及Tm值Table1.PCR primer sequence and it's Tm value

5.3 HUVECs COX－2及PPAR－α基因表達測定采用RT－PCR法，主要步驟包括總RNA提取，總RNA的質量、濃度檢測與標化，RNA逆轉錄，聚合酶鏈式反應(PCR)，瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物相對定量及統(tǒng)計學分析。

5.4 Western blotting法測定人臍靜脈內皮細胞COX－2、PPAR－α蛋白表達 包括蛋白提取、蛋白濃度測定及標化、制備SDS－PAGE變性凝膠、蛋白電泳－轉膜、免疫印跡顯影、產物定量及統(tǒng)計學分析。

5.5 ELISA法檢測培養(yǎng)液中PGE2的濃度 參照試劑盒說明書進行。

5.6 內皮細胞PPAR－α活性測定 包括人臍靜脈內皮細胞核蛋白抽提純化及活性測定，具體方法參照PPAR－α活性測定試劑盒說明書。

6 統(tǒng)計學處理

結 果

1 共孵育后血小板回收計數(shù)結果及活化血小板COX－2、PPAR－α mRNA及蛋白表達的檢測結果

各組血小板與HUVECs共孵育后血小板回收率為(93.4±1.6)%，可計算推出血小板與HUVECs穩(wěn)定結合的量小于加入血小板量的10%，與內皮細胞結合的血小板絕對量小于1×106。血小板為無核細胞，血小板內mRNA及蛋白的表達量為有核細胞的1/12500左右。

在用終濃度為5 μmol/L ADP活化的2×106個血小板中未檢測到COX－2及PPAR－α mRNA及蛋白的表達。

2 免疫活化血小板對HUVECs COX－2 mRNA表達的影響及LDL的作用

正常HUVECs有極少量COX－2 mRNA表達，血小板對照組和ADP對照組HUVECs COX－2 mRNA的表達與對照組相比無明顯變化(0.68±0.21 vs 0.53±0.17，0.77±0.25 vs 0.53±0.17，均 P ＞0.05)，LDL對照組HUVECs COX－2 mRNA的表達似乎有增加，但無顯著差異(0.83±0.26 vs 0.53±0.17，P＞0.05);血小板活化組 HUVECs COX－2 mRNA的表達較ADP對照組及血小板對照組明顯升高(1.49±0.27 vs 0.53±0.17，1.49±0.27 vs 0.68±0.21，均P＜0.01)，血小板活化+LDL組HUVECs COX－2 mRNA的表達較血小板活化組明顯升高(1.79±0.20 vs 1.49±0.27，P ＜0.05)，見圖1A、B。

3 免疫活化血小板對HUVECs PPAR－α mRNA表達的影響及LDL的作用

正常HUVECs細胞有極少量PPAR－α mRNA的表達，血小板對照組、ADP對照組和LDL對照組HUVECs PPAR－α mRNA的表達與對照組相比均無明顯變化(1.17±0.16 vs 1.13±0.17，1.19±0.19 vs 1.13±0.17和1.12±0.14 vs 1.13±0.17，均P＞0.05);血小板活化組HUVECs PPAR－α mRNA的表達較ADP對照組及血小板對照組明顯升高(1.45±0.21 vs 1.19±0.19，1.45±0.21 vs 1.17±0.16，均P＜0.01);血小板活化 +LDL組HUVECs PPAR－α mRNA的表達較血小板活化組明顯升高(1.74±0.23 vs 1.45 ±0.21)，P ＜0.05，見圖1A、C。

4 免疫活化血小板對HUVECs COX－2蛋白表達的影響及LDL的作用

正常培養(yǎng)的HUVECs有極少量COX－2蛋白的表達，血小板對照組、ADP對照組和LDL對照組HUVECs COX－2蛋白的表達與對照組相比均無明顯差異(0.700±0.073 vs 0.570±0.067，0.710±0.072 vs 0.570±0.067和0.580±0.070 vs 0.570±0.067，均P＞0.05);血小板活化組HUVECs COX－2蛋白表達較血小板對照組及ADP對照組明顯升高(1.600±0.145 vs 0.700±0.073，1.600±0.145 vs 0.710±0.072，均P＜0.01);血小板活化+LDL組HUVECs COX－2蛋白的表達較血小板活化組升高(1.970±0.153 vs 1.600 ±0.145，P ＜0.05)，見圖2A、B。

5 免疫活化血小板對HUVECs PPAR－α蛋白表達的影響及LDL的作用

Figure1.Effects of immune－activated platelet and LDL on COX－2 and PPAR－α mRNA expression in HUVECs..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs ADP+coincubation group.A:COX －2，PPAR－α and GAPDH mRNA of HUVECs by RTPCR;B:statistical data of HUVECs COX－2 mRNA expressed in different groups;C:statistical data of HUVECs PPAR－α mRNA expressed in different groups.D2000:D2000 marker;1:control;2:coincubation of platelets with HUVECs;3:coincubation+ADP;4:coincubation+LDL+ADP;5:LDL+coincubation;6:ADP+HUVECs.圖1 免疫活化血小板對人臍靜脈內皮細胞COX－2和PPAR－α mRNA表達的影響及LDL的作用

Figure2.Effects of immune－activate platelet and LDL on COX－2 and PPAR－ α protein expression in HUVECs..n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs ADP+coincubation group.A:COX－2，PPAR－α and GAPDH protein of HUVECs by Western blotting;B:statistical data of HUVECs COX－2 protein expressed in different groups;C:statistical data of HUVECs PPAR － α protein expressed in different groups.1:control;2:coincubation of platelets with HUVECs;3:coincubation+ADP;4:coincubation+LDL+ADP;5:LDL+coincubation;6:ADP+HUVECs.圖2 免疫活化血小板對人臍靜脈內皮細胞COX－2和PPAR－α蛋白表達的影響及LDL的作用

正常HUVECs亦有少量PPAR－α蛋白的表達，血小板對照組、ADP對照組HUVECs PPAR－α蛋白的表達與對照組比較無顯著變化(0.960±0.073 vs 0.980±0.082，0.950±0.094 vs 0.980±0.082，均 P＞0.05);LDL對照組HUVECs PPAR－α蛋白表達與對照組相比似乎有所增加，但無顯著差異(1.120±0.012 vs 0.980±0.082，P ＞0.05);血小板活化組HUVECs PPAR－α蛋白表達較血小板對照組及ADP對照組明顯升高(1.630±0.143 vs 0.960±0.073，1.630±0.143 vs 0.950±0.094，均 P ＜0.01);血小板活化+LDL組HUVECs PPAR－α蛋白的表達也較血小板活化組升高(1.950±0.157 vs 1.630±0.143，P ＜0.05)，見圖2A、C。

6 免疫活化血小板促進HUVECs COX－2活性的增加，活化血小板對HUVECs PPAR－α結合活性無明顯影響，LDL本身無明顯作用，但能夠促進免疫活化血小板的作用，見表2。

表2 各組HUVECs COX－2活性(PGE2濃度)及PPAR－α結合活性對比Table2.Cox－2 activity and PPAR－α binding activity in HUVECs from different groups(.n=6)

表2 各組HUVECs COX－2活性(PGE2濃度)及PPAR－α結合活性對比Table2.Cox－2 activity and PPAR－α binding activity in HUVECs from different groups(.n=6)

＊＊P＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs ADP+platelet+HUVECs.

Group PGE2 concentration(ng/L)PPAR－α binding activity Control 21.31 ±2.34 0.56 ±0.14 Platelet+HUVECs 23.73 ±2.53 0.61 ±0.14 ADP+platelet+HUVECs 42.46 ±5.57＊＊ 0.73 ±0.18 ADP+LDL+platelet+HUVECs 64.35 ±6.19## 0.76 ±0.17 LDL+platelet+HUVECs 25.74 ±3.12 0.64 ±0.16 ADP+HUVECs 22.26 ±2.27 0.58 ±0.13

討 論

COX－2又稱誘導型環(huán)氧合酶，COX－2介導PGs的合成。研究發(fā)現(xiàn)COX－2的高表達僅局限于AS病變處[1]。刺激內皮細胞、單核/巨噬細胞和平滑肌細胞后均可誘導 COX－2的表達[2]，McGeer等[3]發(fā)現(xiàn)COX－2在AS斑塊中的表達水平比正常動脈高4.8倍。Meir等[4]用apoE缺陷型小鼠也得出了類似的結果。近期一系列研究[3－10]認為COX－2對AS尤其是早期AS的形成起促進作用:如COX－2介導的PG產物可以通過多種機制促進AS的進程;COX－2抑制劑有抑制AS的作用。選擇性COX－2抑制劑可以抑制血管炎癥，因而可以延緩AS進程、增加斑塊穩(wěn)定性從而減少粥樣硬化血栓事件。

PPARα屬核受體家族一員，是一種在脂代謝、炎癥及AS中發(fā)揮重要作用的核受體之一，調節(jié)多種靶基因的表達、抑制炎癥、調節(jié)肝臟的急性期反應及血管的炎癥反應[11]。如PPARα缺失小鼠肝臟及血管內皮細胞黏附分子1(VCAM－1)及血清淀粉樣蛋白A的表達水平明顯升高[12，13]。近期研究表明PPAR－α能夠抑制內皮細胞的反應，PPAR－α激動劑能夠抑制炎癥細胞因子如TNF－α誘導的VCAM－1的轉錄表達[14]。PPAR－α的激活能夠抑制T細胞產生IFN－γ和IL－2，從而可能對這些因子的后續(xù)效果產生抑制作用[15，16]。在平滑肌細胞 PPAR－α通過干預NF－κB和AP－1途徑抑制IL－1β誘導的COX－2的表達。

本研究利用血小板與HUVECs共孵育來模擬機體內血小板與血管內皮細胞的相互關系，利用體外免疫活化的血小板直接刺激內皮細胞，發(fā)現(xiàn)免疫活化血小板能夠激活HUVECs，促進HUVECs COX－2 mRNA及蛋白表達的增加，而且COX－2活性也隨之明顯升高，表明COX－2基因表達及活性的增加可能是血小板免疫活化促進AS的一個重要途徑。本實驗中用50 mg/L的LDL直接干預HUVECs未發(fā)現(xiàn)HUVECs COX－2表達及活性有明顯的變化，但同等濃度LDL預干預能夠明顯促進免疫活化血小板刺激HUVECs COX－2的表達及活性的增加。因此LDL有可能通過對血小板或HUVECs的增敏作用間接促進HUVECs COX－2的表達及活性的增加，推測增敏作用可能是LDL促進AS的一個重要方面。

本研究同時發(fā)現(xiàn)免疫活化血小板亦能夠促進PPAR－α mRNA和蛋白的表達，但PPAR－α的活性并沒有明顯增加，也就是說增加PPAR－α的表達并不能達到其相應調節(jié)其它基因表達、抑制炎癥反應的作用。本研究推測免疫活化血小板促進HUVECs PPAR－α的表達可能與其促進了HUVECs其它相關基因表達后的一種被動性、反應性的表達有關，亦或是HUVECs本身對外界炎癥刺激的一種防御反應，反應性地增加PPAR－α的表達。當然亦還可能是免疫活化血小板有雙向作用，既能通過信號途徑促進HUVECs COX－2的表達，亦能通過相同或其它信號途徑促進HUVECs PPAR－α的表達，無論何種方式或途徑，最終結果是增加的PPAR－α表達并不具有相應的活性。本研究結果提示免疫活化血小板可能通過促進內皮細胞COX－2的表達及活性的增加參與了AS的形成和發(fā)展，同時也為臨床用PPAR－α激動劑治療AS提供了一定的理論依據(jù)。

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