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    虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化并下調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36表達(dá)*

    2010-08-02 13:04:36肖銘甲陳衛(wèi)紅趙克森
    中國(guó)病理生理雜志 2010年7期
    關(guān)鍵詞:虎杖低密度脂蛋白

    肖銘甲,陳衛(wèi)紅,吳 煒,郭 文,趙克森,趙 明△

    (南方醫(yī)科大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,廣東省休克微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3南方醫(yī)院消化科,廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510515)

    動(dòng)脈硬化引起的心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類身體健康,是人類兩大致死原因之一。動(dòng)脈硬化發(fā)生的早期表現(xiàn)是巨噬細(xì)胞大量吞噬氧化的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)形成泡沫細(xì)胞。在泡沫細(xì)胞的形成中,巨噬細(xì)胞脂代謝失調(diào)有重要的作用[1]。正常的巨噬細(xì)胞,有一個(gè)脂代謝的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。它經(jīng)過(guò)LDL受體吞噬LDL;而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成或吞噬的脂質(zhì)過(guò)量時(shí),LDL受體的表達(dá)和膽固醇的合成又會(huì)得到抑制,從而保護(hù)巨噬細(xì)胞避免泡沫樣變。氧化的低密度脂蛋白(oxidized LDL,ox-LDL)的作用則不同,它激活和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)清道夫受體,其中以CD36為主;經(jīng)清道夫受體吞噬ox-LDL,沒(méi)有脂代謝的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,使巨噬細(xì)胞大量吞噬脂質(zhì)從而泡沫樣變,泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈壁聚集,形成動(dòng)脈硬化斑塊。

    動(dòng)脈硬化的發(fā)生率在西方約為2‰,而發(fā)展中國(guó)家的發(fā)生率,約為萬(wàn)分之四左右。西方的膳食結(jié)構(gòu)是這個(gè)差別的主要原因。在西方國(guó)家中法國(guó)卻是一個(gè)例外。盡管法國(guó)人也是西方的膳食結(jié)構(gòu),但是,法國(guó)冠心病死亡率只有美國(guó)的三分之一,稱為法蘭西矛盾現(xiàn)象(French paradox),它與法國(guó)人喜飲葡萄酒的習(xí)慣有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)是由于葡萄皮中富含白藜蘆醇的緣故[2]。白藜蘆醇被證明是一種有效的抗氧化劑,它廣泛存在于葡萄、花生等72種植物中。中草藥中以虎杖含量最高?;⒄鹊奶崛∥铮⒄溶?,已經(jīng)被證明具有抗休克作用,作為國(guó)家I類新藥,已經(jīng)進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)。近年來(lái),關(guān)于虎杖苷的降血脂、抗氧化功效也逐漸引起關(guān)注。明確虎杖苷降血脂以及抗氧化的機(jī)制無(wú)疑對(duì)抗衰老和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化具有十分重要的意義。因此我們利用分子探針和流式細(xì)胞儀等手段和儀器,研究了虎杖苷抗氧化的機(jī)制和抑制巨噬細(xì)胞清道夫受體表達(dá)的效果,為虎杖苷在臨床應(yīng)用的進(jìn)一步擴(kuò)大,提供理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 雌性SPF級(jí)C57/BL6小鼠(18-22 g),購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.2 儀器 水平電泳儀(Bio-Rad)、流式細(xì)胞儀(R&D)、低溫超速離心機(jī)(Beckman)、恒溫水浴箱(北京)、超凈操作臺(tái)(蘇州)。

    1.3 試劑 虎杖苷由深圳海王藥業(yè)集團(tuán)提供;普通人血漿購(gòu)自南方醫(yī)院血庫(kù);解離緩沖液(dissociation buffer)、CD36抗體、二氫羅丹明(dihydrorhodamine 123,DHR123)均購(gòu)自Sigma;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide,LPO)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1 LDL的分離與氧化修飾 用1次性密度梯度超速離心法(60000 r/min,6 h)從人血漿中分離LDL,測(cè)得蛋白濃度0.4 g/L[3]。LDL經(jīng)透析膜去除溴化鈉(NaBr)后,置于含5 μmol/L Cu2+的PBS中,37℃溫育8 h。修飾后的 LDL加入 200 μmol/L EDTA終止反應(yīng)。PBS透析24 h去除EDTA,超濾除菌后4℃保存[4]。修飾程度鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳法。

    2.2 動(dòng)物分組及處理 將虎杖苷用生理鹽水配成1.5%的溶液,小鼠腹腔注射0.2 mL/d,對(duì)照組注射等量生理鹽水,連續(xù)注射3 d,第4 d停止注射,第5 d眼球取血處死,75%乙醇消毒,取腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)備用。

    2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將提取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以1×106cells/well的密度接種入24孔板,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

    2.4 SOD檢測(cè) 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,離心后超聲粉碎,再離心,根據(jù)SOD試劑盒(南京建成生物有限公司)說(shuō)明書要求,取細(xì)胞裂解液的上清,采用黃嘌呤氧化酶法,測(cè)定細(xì)胞SOD。

    2.5 LPO檢測(cè) 將提取并培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞給予ox-LDL(50 mg/L)刺激4 h,離心取上清并按照LPO試劑盒(南京建成生物有限公司)說(shuō)明書,應(yīng)用硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TBA法),檢測(cè)細(xì)胞LPO。

    2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)呼吸爆發(fā) 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種于培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h后洗去未貼壁細(xì)胞,向培養(yǎng)基加ox-LDL(50 mg/L),刺激15 min,PBS沖洗終止刺激,用dissociation buffer洗脫細(xì)胞,清洗后用10μmol/L二氫羅丹明(DHR123)處理細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)呼吸爆發(fā)。

    2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD36 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種于培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h后洗去未貼壁細(xì)胞,向培養(yǎng)基加ox-LDL(50 mg/L)。培養(yǎng)24 h后,用 dissociation buffer洗脫細(xì)胞,清洗后用FITC-CD36抗體標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)情況。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用GraphPad軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單向方差分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

    結(jié) 果

    1 虎杖苷提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD的活性

    如圖1所示,虎杖組的巨噬細(xì)胞的SOD明顯高于PBS組(P<0.01)。

    Figure1.Polydatin up-regulated SOD activity in peritoneal macrophages.5 ×105abdominal macrophages from indicated groups were isolated separately.SOD activities in supersonic lycate were assayed as described in the materials and methods section..n=6.*P<0.05 vs PBS group.圖1 虎杖苷顯著提高巨噬細(xì)胞SOD活性

    2 虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)

    圖2A為銅離子修飾的低密度脂蛋白凝膠電泳結(jié)果。可見氧化修飾的低密度脂蛋白由于攜帶負(fù)電荷增加,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)得較快。正常低密度脂蛋白的條帶與正常小鼠血漿中的低密度脂蛋白條帶重合,見圖2A。圖2B示ox-LDL的自由基代謝產(chǎn)物MDA增加,與正常的LDL有顯著區(qū)別。圖2C顯示,ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā),而虎杖苷可以抑制這個(gè)呼吸爆發(fā)的發(fā)生,它與PBS對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。

    3 虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LPO的蓄積

    如圖3所示,PBS處理組的LPO蓄積較少,而給予ox-LDL刺激后,細(xì)胞的LPO蓄積明顯增多,提示細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度較高;而虎杖注射組的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液LPO蓄積低于ox-LDL刺激組。

    4 虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)

    圖4顯示,PBS處理組巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD36水平較低,在給予ox-LDL刺激后,CD36表達(dá)明顯增多;而虎杖苷可有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的CD36表達(dá)(PBS+ox-LDL:91.44±9.07 vs虎杖苷+ox-LDL:49.52 ±2.01)。

    Figure2.Polydatin inhibited ox-LDL-induced respiratory burst in peritoneal macrophages.A:agarose gel electrophoresis result from Cu2+-induced oxidation of LDL.B:MDA assay in ox-LDL..n=6.△P<0.05 vs PBS group.C:5×105abdominal macrophages were incubated with 50 mg/L ox-LDL for 15 min,cells from control group were incubated in standard cultue condition.DHR123 staining was assayed by flow-cytometry..n=6.#P<0.05 vs PBS group;*P<0.05 vs PBS+ox-LDL group.圖2 虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)

    討 論

    巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(respiratory burst)主要是經(jīng)兩大途徑產(chǎn)生超氧陰離子,一是激活細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶,一是破壞線粒體,造成線粒體損傷,線粒體內(nèi)的高能電子滲漏,釋放自由基[5]。氧化的LDL可以循清道夫受體及TLR2、TLR4等受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活NADPH氧化酶在胞漿中的亞基,例如磷酸化p47phox,從而使在胞漿內(nèi)的亞基遷移到質(zhì)膜上,組裝成完整的酶復(fù)合體,發(fā)揮作用。NADPH氧化酶可以被看成是與質(zhì)膜結(jié)合的微小電子傳遞鏈,它能夠?qū)⒎肿友跬ㄟ^(guò)單電子還原產(chǎn)生過(guò)氧化自由基(),并以此為基礎(chǔ)形成一系列二級(jí)產(chǎn)物,這些產(chǎn)物通稱活性氧(reactive oxygen species,ROS)。

    Figure3.Polydatin significantly reduced ox-LDL-induced LPO accumulation in peritoneal macrophages.5×105 abdominal macrophages from indicated groups were isolated,and cultured with 50 mg/L ox-LDL for 4 h.Cells in PBS control group were cultured in standard condition.Cell supernatants were assayed for LPO according to manufactures instruction(see materials and methods section)..n=6.△P<0.05 vs PBS group;*P <0.05 vs PBS+ox-LDL group.圖3 虎杖苷明顯降低ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞LPO蓄積

    Figure4.Polydatin inhibited ox-LDL-induced CD36 expression.5×105abdominal macrophages from indicated groups were incubated with 50 mg/L ox-LDL for 24 h.Cells in PBS control group were under standard culture condition.CD36 expression was assayed by flow-cytometry..n=6.#P<0.05 vs PBS group;*P<0.05 vs PBS+ox-LDL group.圖4 虎杖苷下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)增高

    Figure5.Schematic diagram for the inhibitory target of polydatin in ox-LDL-induced macrophage foam cell formation.① Polydatin inhibited ox-LDL-induced respiratory burst in macrophage;② Reactive oxygen species formation;③ Up-regulated SOD activity and protected mitochondria,inhibited activation of MAP kinases and PPARγ transactivation on the regulation of CD36 expression;④ Inhibition of macrophage uptake lipids and foam cells formation.圖5 虎杖苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的可能靶點(diǎn)示意圖

    這些活性氧的產(chǎn)生可進(jìn)一步攻擊線粒體膜上的脂質(zhì),使其過(guò)氧化而破壞線粒體膜的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),造成線粒體高能電子和氧自由基的釋放。線粒體呼吸鏈由4種復(fù)合物組成,其中復(fù)合體III的Q循環(huán)中Qo位點(diǎn)中半醌自由基(UQH·)已明確是的單電子來(lái)源。已有報(bào)道證明,白藜蘆醇可以抑制線粒體復(fù)合物III產(chǎn)生的超氧陰離子[6],因而白藜蘆醇具有抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生兩大途徑的雙重功能。我們的結(jié)果顯示,虎杖苷對(duì)抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)及自由基產(chǎn)生具有十分顯著的作用。

    細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化劑和抗氧化酶兩部分。虎杖苷作為抗氧化劑本身具有一定的抗氧化能力,但是它對(duì)抗氧化酶表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)則具有十分重要的意義。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶和清除自由基的首要物質(zhì)。它催化如下反應(yīng):+2H+→H2O2+O2,因而它可以淬滅NADPH氧化酶產(chǎn)生的以及線粒體滲透出來(lái)的超氧陰離子為過(guò)氧化氫和氧氣,從而阻斷氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn),虎杖苷能夠增強(qiáng)SOD的活性,從而淬滅巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)生的氧自由基,阻斷自由基作為第二信使的進(jìn)一步反應(yīng)。

    自由基在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮第二信使的作用,誘導(dǎo)細(xì)胞作出一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng),例如細(xì)胞骨架的改變,細(xì)胞因子的表達(dá)釋放和細(xì)胞膜蛋白受體的表達(dá),包括清除氧化低密度脂蛋白的清道夫受體CD36等[8]。CD36是巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白的主要受體。Febbraio等[9]用CD36基因敲除小鼠來(lái)研究其在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的作用。他們發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,敲除CD36基因后,小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的結(jié)合和攝取能力顯著降低。在有關(guān)人巨噬細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn),CD36基因的表達(dá)對(duì)ox-LDL的結(jié)合和攝取有一定的影響。在亞洲人群中檢測(cè)到CD36基因的多態(tài)性,該基因多態(tài)性可導(dǎo)致CD36表達(dá)缺陷(NAKa-表型)。與正常對(duì)照組的細(xì)胞相比,這些病人體內(nèi)分離出來(lái)的單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞與ox-LDL和膽固醇酯的結(jié)合減少了40%,這進(jìn)一步表明了CD36是 ox-LDL的生理性受體[10]。CD36/apoE雙基因敲除鼠(DKO)喂飼高脂飲食后,小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積減少了70%,文獻(xiàn)報(bào)道[11]CD36是致動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)的主要受體。我們以往的研究證明,ox-LDL誘導(dǎo)的CD36表達(dá)是經(jīng)過(guò)MAPK激酶通路調(diào)節(jié)的。ox-LDL激活p38蛋白激酶,而p38蛋白激酶抑制劑特異而有效地阻斷ox-LDL誘導(dǎo)的CD36的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示,p38蛋白激酶是通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ的活性調(diào)控CD36的表達(dá)[12]。因此,氧化應(yīng)激對(duì)CD36的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。本文的結(jié)果顯示,虎杖苷有抑制ox-LDL誘導(dǎo)CD36表達(dá)的作用,這其間的主要機(jī)制是它的抗氧化功能起作用,其下調(diào)CD36的機(jī)制可能也包括阻滯MAPK家族成員對(duì)PPARγ(CD36調(diào)控的關(guān)鍵蛋白)的磷酸化作用。我們的后續(xù)工作會(huì)對(duì)此問(wèn)題繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。

    [1]宋 武,蔡海江.巨噬細(xì)胞乙酰LDL受體的研究[J].中國(guó)病理生理雜志,1988,4(2):66 -70.

    [2]趙克森.白藜蘆醇的一般生物學(xué)作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2002,24(6):374-376.

    [3]張林華,劉秉文.一次性梯度密度離心超速分離人血漿脂蛋白[J].生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào),1992,21(3):257.

    [4]劉尚喜,陳 媛,周 玫.低密度脂蛋白的氧化修飾和丙二醛修飾的比較研究[J].生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào),1992,24(6):569.

    [5]Bae YS,Lee JH,Choi SH,et al.Macrophages generate reactive oxygen species in response to minimally oxidized low-density lipoprotein:toll-like receptor 4- and spleen tyrosine kinase-dependent activation of NADPH oxidase 2[J].Circ Res,2009,104(2):210 -218.

    [6]Shin SM,Cho IJ,Kim SG.Resveratrol protects mitochondria against oxidative stress through AMP-activated protein kinase-mediated glycogen synthase kinase-3 beta inhibition downstream of poly(ADP-ribose)polymerase-LKB1 pathway[J].Mol Pharmacol,2009,76(4):884 -895.

    [7]Morin D,Papadopoulos V,Tillement JP.Prevention of cell damage in ischemia:novel molecular targets in mitochondria[J].Expert Opinion Therapeutic Targets,2002,6(3):315-334.

    [8]Cho S,Park EM,F(xiàn)ebbraio M,et al.The class B scavenger receptor CD36 mediates free radical production and tissue injury in cerebral ischemia[J].J Neurosci,2005,25(10):2504-2512.

    [9]Febbraio M,Hajjar DP,Silverstein RL.CD36:a class B scavenger receptor involved in angiogenesis,atherosclerosis,inflammation,and lipid metabolism [J].J Clin Invest,2001,108(6):785 -791.

    [10]Morii T,Ohno Y,Kato N,et al.CD36 single nucleotide polymorphism is associated with variation in low-density lipoprotein-cholesterol in young Japanese men[J].Biomarkers,2009,14(4):207 -212.

    [11]Kuchibhotla S,Vanegas D,Kennedy DJ,et al.Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knockout mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor A I/II[J].Cardiovasc Res,2008,78(1):185-196.

    [12]Zhao M,Liu YW,Wang XF,et al.Activation of the p38 MAP kinase pathway is required for foam cell formation from macrophages exposed to oxidized LDL[J].APMIS,2002,110(6):458-468.

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