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    IL-1β和IL-6對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的影響*

    2010-08-02 13:04:34韓敦富施彥璋陳志維李逸群劉尚禮
    中國病理生理雜志 2010年7期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)腰痛膠原

    王 剛,韓敦富,施彥璋,陳志維,李逸群,劉尚禮△

    (1佛山市中醫(yī)院骨科,廣東 佛山 528000;2中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510120;3汕頭市中心醫(yī)院骨科,廣東 汕頭 515031)

    源于椎間盤的腰痛仍是目前社會(huì)中嚴(yán)重影響人們生活和致殘的常見原因之一[1],研究表明,傷害感受器神經(jīng)纖維的長入可能是導(dǎo)致椎間盤源性腰痛發(fā)生的基礎(chǔ)[2,3],神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor,NGF)在促進(jìn)神經(jīng)纖維長入椎間盤過程中可能起到了關(guān)鍵作用[4]。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β等在退變椎間盤中高表達(dá)[5],并且可以大大提高椎間盤細(xì)胞分泌 NGF[6,7];進(jìn)一步研究表明,IL-6、IL-8在疼痛的椎間盤高表達(dá),而TNF-α、IL-1β則表達(dá)較低[8]。因此,我們推測 IL-6、IL-8等在促進(jìn)椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生NGF,誘導(dǎo)神經(jīng)長入過程中可能發(fā)揮了更重要的作用。因此,本文目的旨在觀察IL-1β和IL-6對(duì)體外培養(yǎng)的人椎間盤髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的影響。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 主要試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Hyclone),IL-1β 及 IL-6(Peprotechec),Trizol(Invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng) (reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(TaKaRa),PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),蛋白裂解液 (申能博彩,進(jìn)口分裝),β -actin、NGF-β 單克隆抗體(Newmarker),Ⅱ型膠原單克隆抗體(Chemicon),羊抗兔Ⅱ抗(晶美生物有限公司),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence,ECL)(晶美生物有限公司)。

    1.2 人髓核細(xì)胞來源 將取自特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者的髓核組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng),男女各2例,年齡在10-15歲之間,L2/L3節(jié)段2例,L3/L4節(jié)段2例,所取節(jié)段椎間盤術(shù)前MRI顯示Pfirrmann退變分級(jí)[8]為 1 級(jí)。

    2 方法

    2.1 髓核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 前路手術(shù)取出椎間盤組織后立刻裝入50 mL無菌離心管,置于冰盒后即刻送往實(shí)驗(yàn)室。椎間盤組織用冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)溶液漂洗3次,分離出中央膠凍樣髓核組織,在DMEM/F12培養(yǎng)基中將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織顆粒,1000 r/min離心5 min,去上清液,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各1×105U/L)重懸后轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h,然后離心去上清,PBS漂洗后,依次用0.25%胰蛋白酶、2%Ⅱ型膠原酶消化后,收集上清液,1000r/min離心 5 min,去除上清液,再加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打均勻后計(jì)數(shù),以3×105cells/cm2濃度轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板或25 cm2培養(yǎng)瓶在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。細(xì)胞貼壁后,每2-3 d換液1次,按時(shí)用倒置顯微鏡觀察、拍照。

    2.2 髓核細(xì)胞鑒定 制備好細(xì)胞爬片,用新鮮配制的4%多聚甲醛固定20 min。甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞糖胺多糖的分泌能力:將固定好的細(xì)胞爬片,10 g/L甲苯胺藍(lán)室溫染色10 min,光學(xué)顯微鏡觀察拍照。番紅-O染色觀察蛋白多糖的分泌能力:將固定好的細(xì)胞爬片,用1%番紅-O室溫浸染30 min,光鏡下觀察拍照。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定Ⅱ型膠原分泌情況:將固定好的細(xì)胞爬片,3%H2O2甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min,正常山羊血清室溫封閉20 min,滴加1∶150稀釋的Ⅱ型膠原單克隆抗體,4℃孵育過夜,滴加生物素化Ⅱ抗,37℃孵育20 min,滴加SABC試劑 37℃ 20 min,滴加新鮮配制的DAB顯色劑,鏡下控制顯色。并設(shè)置陰性對(duì)照組。沖洗、脫水、封片,光鏡下觀察拍照。

    2.3 IL-1β、IL-6和髓核細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后,更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,更換為含0.3% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組中分別加入(10 μg/L、50 μg/L)IL-1β、IL-6共培養(yǎng)48 h,分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、RT-PCR和Western blotting檢測細(xì)胞表達(dá)NGF的情況。

    2.4 IL-1β、IL-6和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后 NGF表達(dá)的檢測

    ①免疫組織化學(xué)法檢測髓核細(xì)胞NGF的表達(dá)情況步驟同Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

    ②RT-PCR檢測髓核細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá) 共培養(yǎng)48 h時(shí)棄去上清液,加入Trizol提取總RNA,采用TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR kit試劑盒二步法RT-PCR檢測 NGF mRNA的表達(dá)。NGF-β、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上、下游引物序列及產(chǎn)物長度見表1,擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,MacintoshⅡ圖像分析軟件進(jìn)行吸光度掃描分析,以目的條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH吸光度比值表示目的基因表達(dá)水平。

    表1 NGF-β、GAPDH上、下游引物序列及產(chǎn)物長度Table1.The primer and the length of NGF and GAPDH

    ③Western blotting檢測髓核細(xì)胞NGF蛋白表達(dá) 共培養(yǎng)48 h時(shí)棄去上清液,加入蛋白裂解液提取總蛋白,制備樣品并配置SDS(sodium-dodecyl sulphate)-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)凝膠,行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移聚乙烯二氟

    (polyvinylidene difluoride,PVDF)膜和膜封閉,封閉結(jié)束后,孵育Ⅰ抗4℃過夜(NGF-β和β-actinⅠ抗稀釋度均為1∶1000),1×PBST洗滌3次,每次5 min,室溫孵育Ⅱ抗(稀釋度1∶1000)1 h。將 ECL發(fā)光試劑涂于PVDF膜上,反應(yīng)1-3 min,置于暗盒中使X光膠片曝光2-30 min,顯影定影,照像留底。用MacintoshⅡ圖像分析系統(tǒng)計(jì)算分析條帶的灰度值,用NGF-β與相應(yīng)β-actin條帶值的比值反映β-NGF表達(dá)的變化。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 髓核細(xì)胞鑒定

    自髓核組織中分離和培養(yǎng)出的髓核細(xì)胞,可被甲苯胺藍(lán)、番紅-O深染色,具有分泌糖胺多糖和蛋白多糖能力;Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定該類型細(xì)胞可分泌Ⅱ型膠原,見圖1。

    Figure1.The identification of nucleus pulposus cells(×200).A:the staining of toluidine blue;B:the staining of safranine-O;C:immunocytochemical staining of collagen-II.圖1 髓核細(xì)胞的鑒定

    2 髓核細(xì)胞和IL-1β、IL-6共培養(yǎng)后NGF表達(dá)情況

    2.1 髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測 各組中髓核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中均出現(xiàn)彌散的淡黃染色,分別和IL-1β、IL-6共培養(yǎng)后的髓核細(xì)胞彌散的淡黃染色稍增多,見圖2。

    2.2 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞 NGF mRNA 表達(dá)的影響 髓核細(xì)胞分別和不同濃度的IL-1β、IL-6共培養(yǎng)48 h后,提取總RNA行RT-PCR檢測NGF mRNA表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,10 μg/L、50 μg/L IL-1β組分別上調(diào)了髓核細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá)約2.6、2.8 倍,而10 μg/L、50 μg/L IL -6 組分別上調(diào)了約3.6、4.1倍,見圖3、表2。

    Figure2.Immunocytochemical staining of NGF in nucleus pulposus cells(×200).A:control;B:stimulated by IL-1β (50 μg/L);C:stimulated by IL -6(50 μg/L).圖2 髓核細(xì)胞NGF免疫組織化學(xué)染色

    2.3 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞 NGF蛋白表達(dá)的影響 共培養(yǎng)48 h后提取總蛋白用Western blotting檢測NGF蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,10 μg/L、50 μg/L IL-1β組分別上調(diào)了髓核細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)約5.4、5.8 倍,而10 μg/L、50 μg/L IL -6 組分別上調(diào)了約7.4、8.0倍,結(jié)果和RT-PCR檢測的NGF mRNA表達(dá)結(jié)果相一致,見圖4、表2。

    Figure3.The expression of NGF mRNA in the nucleus pulposus cells after IL-1β or IL-6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL - 1β;3:50 μg/L IL - 1β;4:10 μg/L IL -6;5:50 μg/L IL -6.圖3 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞NGF mRNA表達(dá)的影響

    Figure4.The expression of NGF protein in the nucleus pulposus cells after IL-1β or IL-6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL - 1β;3:50 μg/L IL - 1β;4:10 μg/L IL -6;5:50 μg/L IL -6.圖4 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞NGF蛋白表達(dá)的影響

    表2 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞NGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL-1β or IL-6 stimulation(.n=3)

    表2 IL-1β、IL-6對(duì)髓核細(xì)胞NGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL-1β or IL-6 stimulation(.n=3)

    **P <0.01 vs control group;△△P <0.01 vs IL-1β.

    Group NGF mRNA NGF protein Control 1.00 ±0.10 1.00 ±0.20 IL -1β10 μg/L 2.60 ±0.26** 5.40 ±0.30**IL -1β 50 μg/L 2.80 ±0.25** 5.80 ±0.28**IL -610 μg/L 3.60 ±0.22**△△ 7.40 ±0.40**△△IL -650 μg/L 4.10 ±0.23**△△ 8.00 ±0.45**△△

    討 論

    椎間盤為“三明治”結(jié)構(gòu),上下為軟骨終板,與上下方椎體相連,中間部分的內(nèi)外層分別為髓核和纖維環(huán)。正常人類椎間盤除纖維環(huán)的外1/3存在血管神經(jīng)外基本是一個(gè)不含神經(jīng)血管組織,然而研究發(fā)現(xiàn),在疼痛椎間盤中,微血管伴隨神經(jīng)末梢通過終板長入正常無血管的椎間盤內(nèi)部[2,3]。Peng 等[2]的研究發(fā)現(xiàn),椎間盤源性腰痛病人椎間盤中,新生的神經(jīng)纖維和毛細(xì)血管沿椎間盤裂隙的肉芽組織長入纖維環(huán)和髓核,這種神經(jīng)纖維的長入以及神經(jīng)分布密度的增加可能是椎間盤源性疼痛的解剖基礎(chǔ)。

    與感受疼痛相關(guān)的神經(jīng)元分為NGF依賴性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)依賴性神經(jīng)元。NGF依賴性神經(jīng)元表達(dá)P物質(zhì)(substance P,SP)及降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP),與炎癥疼痛相關(guān);GDNF依賴性神經(jīng)元表達(dá)結(jié)合凝集素B4,與各種疼痛如神經(jīng)損害相關(guān)的神經(jīng)性疼痛有關(guān)。在人類椎間盤中感覺神經(jīng)元是表達(dá)CGRP神經(jīng)元纖維,未發(fā)現(xiàn)結(jié)合凝集素B4神經(jīng)元纖維,椎間盤感覺神經(jīng)纖維主要是與炎癥疼痛相關(guān)的包含神經(jīng)肽的 NGF依賴性小神經(jīng)元[9,10]。NGF在疼痛椎間盤中的表達(dá)較在無癥狀的椎間盤中明顯增加,且存在表達(dá)NGF受體TrkA的神經(jīng)纖維和微小血管[1,2]。NGF 能支持神經(jīng)元存活,促進(jìn)其生長、分化,維持其功能[11],對(duì)NGF起反應(yīng)的神經(jīng)元主要有交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞膽堿能神經(jīng)元,NGF由這些神經(jīng)元的靶組織產(chǎn)生,被神經(jīng)元的軸突末梢攝取,籍逆運(yùn)行運(yùn)輸?shù)桨w,為這些神經(jīng)元的存活和維持所必需,所以,NGF是典型的靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長依賴于髓核細(xì)胞分泌的NGF[12],提示髓核細(xì)胞產(chǎn)生的NGF可能是神經(jīng)長入退變的椎間盤啟動(dòng)因素。

    NGF具有營養(yǎng)神經(jīng)和致敏傷害感受器的作用,在炎癥組織中NGF的合成明顯增加[13]。致炎因子IL-1β和TNF-α已被確定與椎間盤退變有明確關(guān)系[5],且可誘發(fā)椎間盤細(xì)胞分泌 NGF[6,7],從而誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的長入和致敏椎間盤感覺神經(jīng)末梢而導(dǎo)致盤源性腰痛的發(fā)生。然而,Burke等[8]研究顯示椎間盤源性腰痛患者的椎間盤中促炎因子IL-6、IL-8、PGE的表達(dá)比不伴腰痛的坐骨神經(jīng)痛腰椎間盤突出患者明顯增高,卻未檢測到IL-1β和TNF-α的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示,IL-6、IL-8在退變的椎間盤中表達(dá)明顯升高,而IL-1β和TNF-α則在椎間盤突出周圍的肉芽組織中高表達(dá)[14]。因此,我們推測IL-6、IL-8等因子在導(dǎo)致椎間盤源性腰痛的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要作用,但其是否通過提高椎間盤細(xì)胞分泌NGF進(jìn)而誘發(fā)了一系列反應(yīng)這一具體機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。

    本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6均可增強(qiáng)體外培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞產(chǎn)生NGF的能力,同等濃度下IL-6具有更強(qiáng)的上調(diào)作用。但I(xiàn)L-1β、IL-6在正常和退變?nèi)俗甸g盤中的表達(dá)量尚需進(jìn)一步確定以明確其在何種濃度下何者發(fā)揮了更重要的作用。結(jié)合以往文獻(xiàn),這一結(jié)果說明IL-6等因子可能通過提高椎間盤細(xì)胞分泌NGF,從而誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長入椎間盤而導(dǎo)致盤源性腰痛的發(fā)生。

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