細(xì)胞因子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)巰基亞硝基化對大鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中CREB蛋白的 DNA結(jié)合活性的影響*

張曉靜，叢 斌△，張鳳華，李淑瑾，馬春玲，付麗紅，倪志宇，于 峰

(1河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050091)

一氧化氮(nitric oxide，NO)可對蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基(－SH)進(jìn)行多種形式的氧化修飾，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，這是NO發(fā)揮多種生物學(xué)作用的機(jī)制之一。研究證實(shí)，高濃度NO主要引起巰基發(fā)生不可逆性氧化修飾，是NO介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的主要機(jī)制;相反，低濃度NO可對巰基進(jìn)行可逆性氧化修飾，既可以保護(hù)巰基免受不可逆性氧化，又可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡[1]。蛋白質(zhì)巰基亞硝基化是一種NO誘導(dǎo)的可逆性巰基氧化修飾，產(chǎn)物為亞硝基化蛋白質(zhì)(S －nitrosated protein，PSNO)[2]。研究證實(shí)，NO 可通過亞硝基化抑制核因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)和活性蛋白 －1(active protein－1，AP－1)等轉(zhuǎn)錄因子的活性[3，4]，提示亞硝基化作用可以從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能和狀態(tài)。

成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast－like synoviocytes，F(xiàn)LS)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病過程中過度增殖，在炎癥的起始和持久化以及關(guān)節(jié)破壞方面發(fā)揮重要作用[5]。在RA發(fā)病過程中，F(xiàn)LS中的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (cAMP response element binding protein，CREB)的激活是導(dǎo)致FLS過度增殖的重要環(huán)節(jié)[6]。抑制CREB活化成為抑制FLS增殖的關(guān)鍵。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，用NO供體直接作用于FLS的核蛋白，可引起亞硝基化修飾，并抑制白細(xì)胞介素 －1β(interleukin－1β，IL－1β)誘導(dǎo)的CREB的DNA結(jié)合活性，提示CREB對NO誘導(dǎo)的巰基氧化修飾具有敏感性[7]。亞硝基化反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境及NO濃度等多種因素有關(guān)[8]。FLS內(nèi)源性生成的NO能否引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生亞硝基化修飾，對CREB的DNA結(jié)合活性有何調(diào)節(jié)作用均未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)將對上述問題進(jìn)行探討，為揭示NO在RA中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為RA的治療提供新的思路。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 亞硝基化谷胱甘肽(S－nitrosogluthathione，GSNO)、還原型谷胱甘肽(gluthathione，GSH)、甲基甲基硫代甲砜(methyl methanethiosulfonate，MMTS)、新亞銅樹堿(neocuproine)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、生物素化低分子量 marker、氨基胍(aminoguanidine，AG)、抗壞血酸(vitamin c，VC)均購自Sigma;N－(6－[生物素胺]己基)－3－(2－吡啶二硫)丙酰胺N－[6－(biotinamido)hexyl]－3－(2－pyridyldithio)propio namide(biotin－HPDP)為Pierce產(chǎn)品 ;重組白細(xì)胞介素 －1β(recombinant interleukin－1β，rIL－1β)和重組干擾素 －γ(recombinant interferon －γ，rIFN －γ)為 R＆D 產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限。[γ－32P]ATP為北京亞輝生物公司產(chǎn)品，電泳遷移率改變分析(electrophoretic mobility shift analysis，EMSA)和CREB結(jié)合序列寡核苷酸均為Promega產(chǎn)品。NO測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RSC－364)為北京解放軍總醫(yī)院骨病研究所黃靖香主任惠贈，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2 方法

2.1 RSC－364細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞硝基化水平的檢測

①實(shí)驗(yàn)分組 對照組:DMEM培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的生理鹽水，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β組:DMEM培養(yǎng)基中加入20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL －1β，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑AG組:DMEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L AG，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+AG組:DMEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L AG 后，加入 20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL－1β的混合物，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+DTT組:DMEM培養(yǎng)基中加入 20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL －1β，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h，提取總蛋白與10 mmol/L DTT室溫避光反應(yīng)15 min。各組孵育相應(yīng)時(shí)間后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行NO含量測定，并提取總蛋白立即進(jìn)行生物素轉(zhuǎn)化(biotin switch method)。

②細(xì)胞上清液中NO含量測定 按照試劑盒說明書操作。

③ 提取細(xì)胞總蛋白 細(xì)胞濃度為1×106cells/瓶，刮除法收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，測量細(xì)胞壓積(packed cell volume，PCV)，加入20倍 PCV 的 Hen buffer(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，含1%NP－40)，冰浴20 min，4℃ 10000 r/min離心15 min，收集上清液用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，用Hen buffer將各組蛋白濃度調(diào)整為0.5 g/L，進(jìn)行生物素轉(zhuǎn)化。以下實(shí)驗(yàn)需避光操作。

④ 生物素轉(zhuǎn)化[9]原理:先將蛋白質(zhì)分子中未發(fā)生亞硝基化的巰基用MMTS封閉，對發(fā)生亞硝基化的位點(diǎn)無明顯影響，再用還原劑VC選擇性還原亞硝基化的位點(diǎn)為自由巰基，最后用生物素標(biāo)記自由巰基，這樣生物素就被標(biāo)記在原發(fā)生亞硝基化的位點(diǎn)，將不穩(wěn)定的亞硝基化轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的生物素化，因此直接檢測生物素化蛋白表達(dá)水平可直接反映蛋白的亞硝基化修飾水平。方法:分別用封閉液(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，2.5%SDS，20 mmol/L MMTS)重懸各組蛋白(蛋白濃度為0.5 g/L)，50℃反應(yīng)30 min，每4 min振蕩1次。加入2倍體積冰丙酮，－20℃反應(yīng)10 min，4℃ 3000 r/min離心10 min，棄上清除去多余MMTS。用Hens buffer(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，1%SDS)重懸蛋白，加入 4 mmol/L biotin－HPDP(用 DMSO配制)和1 mmol/L VC，室溫反應(yīng)1 h，每10 min振蕩1次。以上各組均設(shè)無生物素標(biāo)記組為陰性對照組，無生物素標(biāo)記組加相同體積DMSO。生物素標(biāo)記后進(jìn)行免疫印跡(Western blotting)。以下實(shí)驗(yàn)不再需要避光操作。⑤Western blotting 將等體積上樣緩沖液(不含還原劑)直接加入到蛋白樣品中混勻，經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。TBS振蕩漂洗過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素(抗體稀釋度為1∶200)，37℃孵育1 h。TBS振蕩漂洗后ECL顯色，Kodax X光片曝光照相。

2.2 采用電泳遷移率改變分析(electrophoresis mobility shift assay，EMSA)技術(shù)研究亞硝基化作用對CREB活性的影響

①實(shí)驗(yàn)分組 對照組:DMEM培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的生理鹽水，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。rIL－1β組:DMEM培養(yǎng)基中加入IL－1β 10 μg/L 37℃孵箱中孵育12 h。rIL－1β+rIFN－γ組:DMEM培養(yǎng)基中加入10 μg/L rIL－1β和20 μg/L rIFN－γ，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育12 h。AG組:DMEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L AG，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。AG+rIL－1β+rIFN－γ組:DMEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L AG、10 μg/L rIL－1β 和20 μg/L rIFN － γ，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+DTT組:DMEM培養(yǎng)基中加入20 μg/L rIFN－γ和10 μg/L rIL－1β，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育12 h，提取核蛋白與10 mmol/L DTT室溫避光反應(yīng)15 min。以上實(shí)驗(yàn)均避光操作。各組于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)提取核蛋白進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)檢測CREB DNA結(jié)合活性。

②提取細(xì)胞核蛋白 刮除法收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，4℃1850 r/min離心10 min，測量PCV，按文獻(xiàn)操作提取核蛋白[3]。用考馬斯亮藍(lán)法測定核蛋白含量。

③CREB結(jié)合序列寡核苷酸的同位素標(biāo)記及純化探針 含有CREB特異性識別位點(diǎn)的雙鏈脫氧寡核苷酸為5’－AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG －3’，用T4多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記[γ－32P]ATP，乙醇沉淀法純化標(biāo)記的寡核苷酸，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

④DNA與核蛋白的結(jié)合反應(yīng)(避光操作) 取30 μg核蛋白與同位素標(biāo)記的DNA探針(3.5 pmol/L)在室溫下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30min。為了檢測CREB結(jié)合序列寡核苷酸的特異性，設(shè)立了陰性對照(反應(yīng)體系中不加核蛋白提取物)、陽性對照、競爭性抑制結(jié)合(反應(yīng)體系中加入未標(biāo)記的CREB結(jié)合序列寡核苷酸)以及非競爭性抑制結(jié)合(反應(yīng)體系中加入未標(biāo)記的AP－2結(jié)合序列寡核苷酸)4個(gè)組。

⑤DNA－蛋白結(jié)合物電泳 取上述 DNA與核蛋白結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物加載樣buffer混勻后，經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(避光操作)，真空干燥凝膠，－80℃ 放射自顯影48 h，顯影后掃描至計(jì)算機(jī)中，用凝膠分析軟件對電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，取其面積與熒光強(qiáng)度的乘積AU(Darea·Ddensity)代表CREB的相對活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析，用最小顯著差異法作兩兩比較。

結(jié) 果

1 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞硝基化修飾水平的影響

在標(biāo)記生物素的4個(gè)組中，對照組沒有見到明顯條帶，而rIFN－γ與rIL－1β組可明顯見到1組由低分子量到高分子量的條帶，表明二者共孵育使細(xì)胞中亞硝基化修飾水平升高。如果培養(yǎng)液中預(yù)先加入AG可抑制rIFN－γ和rIL－1β引起的亞硝基化反應(yīng)。在細(xì)胞因子作用12 h后，使提取的蛋白與DTT(巰基氧化修飾的還原劑)直接反應(yīng)，可導(dǎo)致條帶消失，表明DTT逆轉(zhuǎn)了亞硝基化反應(yīng)。各組均在分子量為39 kD和58 kD之間有弱的、吸光度一致的內(nèi)源性生物素化蛋白的表達(dá)，見圖1。

Figure1.The effect of the combination stimulation of rIFN－γ and rIL－1β on NO production in RSC －364 cells.After RSC－364 cells were incubated with rIL－1β and rIFN－γ in the presence or absence of AG for 12 h，cell culture supernatant was collected to determine NO contents..n=3＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs rIL－1β+rIFN－γ group.圖1 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對RSC－364細(xì)胞NO生成水平的影響

2 NO含量檢測結(jié)果

與對照組(4.34±2.82)μmol/L相比，細(xì)胞因子聯(lián)合孵育細(xì)胞后培養(yǎng)液上清中NO含量增高[(30.93±4.80)μmol/L，P ＜0.01]，而同時(shí)應(yīng)用 AG可逆轉(zhuǎn)rIFN－γ與rIL－1β的作用[(4.70±2.63)μmol/L，P＜0.01]。單獨(dú)應(yīng)用AG對培養(yǎng)液上清中NO含量無明顯影響[(5.40±2.47)μmol/L，P＞0.05]，見圖 2。

Figure2.The effect of the combination stimulation of rIFN－γ and rIL－1β on the S－nitrosylation level in RSC－364 cells.After RSC －364 cells were incubated with rIL－1β and rIFN－γ in the presence or absence of AG for 12 h，the total proteins from each group were prepared.After the reaction of the total proteins from rIL－1β +rIFN－γ group with DTT for 15 min in vitro，the total proteins from each group were subjected to the biotin switch assay，then the S－nitrosylation level was assayed by Western blotting.Molecular mass markers are shown(MM).圖2 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞硝基化修飾水平的影響

3 聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子對CREB活性的影響

rIL－1β孵育細(xì)胞12 h后，CREB的 DNA結(jié)合活性明顯高于對照組(P＜0.01)。聯(lián)合應(yīng)用rIL－1β和rIFN－γ 12 h后可部分抑制CREB的DNA結(jié)合活性(P＜0.01)，預(yù)先加入AG可減弱rIL－1β和rIFN－γ共孵育對CREB的DNA結(jié)合活性的抑制作用(P＜0.01)。核蛋白中加入DTT可明顯逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因子共孵育的作用(P＜0.01)，見圖3。

討 論

Figure3.Effect of S－nitrosylation induced by rIFN－γ and rIL－1β on DNA binding activities of CREB in RSC －364 cells.Representative autoradiography picture of three experiments of EMSA..n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs rIL－1β group;##P＜0.01 vs rIL－1β+rIFN －γ group.Lane 1:negative control;Lane 2:positive control;Lane 3:[32P]－labeled CREB Oligo plus unlabeled CREB(competitor);Lane 4:[32P]－labeled CREB Oligo plus unlabeled AP－2 Oligo(noncompetitor);Lane 5:control group;Lane 6:rIL－1β group;Lane 7:rIL－1β+rIFN－γ group;Lane 8:rIL－1β+rIFN－γ+DTT group;Lane 9:rIL－1β+rIFN－γ+AG group;Lane 10:AG group.圖3 rIFN－γ和rIL－1β誘導(dǎo)的亞硝基化反應(yīng)對CREB的DNA結(jié)合活性的影響

細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO，但引起的生物學(xué)效應(yīng)與NO的濃度有關(guān)。NO的濃度需達(dá)到靜息狀態(tài)的20倍以上，才有可能引起不可逆性巰基氧化修飾，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10];相反，低濃度NO可通過亞硝基化修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能和狀態(tài)[1]。因此在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們檢測了不同濃度的rIFN－γ和rIL－1β誘導(dǎo)NO生成的水平，結(jié)果顯示10 μg/L rIL－1β和20 μg/L rIFN－γ誘導(dǎo)NO生成的量約為靜息狀態(tài)的8倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及能夠引起氧化損傷的水平。因此，我們選用該濃度的rIFN－γ和rIL－1β進(jìn)行亞硝基化研究。結(jié)果顯示，rIFN－γ和rIL－1β共孵育可使亞硝基化修飾水平升高;而預(yù)先應(yīng)用AG可抑制此效應(yīng)，提示rIFN－γ和rIL－1β可通過誘導(dǎo)NO生成，引起亞硝基化修飾。我們還觀察到，在細(xì)胞因子孵育細(xì)胞后提取總蛋白，與DTT直接反應(yīng)，幾乎看不到亞硝基化修飾。這是因?yàn)镈TT能水解亞硝基化位點(diǎn)為自由巰基[11]，導(dǎo)致亞硝基化位點(diǎn)無法被生物素標(biāo)記，因此沒有明顯條帶顯示 (圖1)。這進(jìn)一步表明，細(xì)胞因子共孵育可引起細(xì)胞內(nèi)亞硝基化修飾水平升高。實(shí)驗(yàn)中，各組均在分子量為39kD和58kD之間有弱的內(nèi)源性生物素化蛋白的表達(dá)(圖1)，這些內(nèi)源性生物素化蛋白表達(dá)水平基本一致，可以作為內(nèi)參來確保上樣量的一致性[7，9]。

IL－1β是活化FLS中CREB的重要炎癥介質(zhì)之一[6]。我們分別用rIL－1β單獨(dú)或rIL－1β與rIFN－γ聯(lián)合孵育細(xì)胞，檢測CREB的DNA結(jié)合活性(以下簡稱活性)。結(jié)果顯示，rIL－1β單獨(dú)刺激可增強(qiáng)CREB的活性，rIL－1β和rIFN－γ共孵育卻可抑制CREB的活性，而預(yù)先應(yīng)用AG可減弱細(xì)胞因子共孵育的作用，提示，細(xì)胞因子共孵育可通過誘導(dǎo)內(nèi)源性NO產(chǎn)生，抑制CREB的活性。由于細(xì)胞因子共孵育可通過誘導(dǎo)內(nèi)源性NO產(chǎn)生，引起亞硝基化修飾水平升高，因此，我們進(jìn)一步探討了亞硝基化修飾水平升高對CREB活性的影響。

亞硝基化是NO衍生的氮氧化物如三氧化二氮(N2O3)直接對巰基進(jìn)行氧化修飾的過程，化學(xué)反應(yīng)式為:N2O3+PSH→PSNO+NO2－+H+[12]。另外，發(fā)生亞硝基化的蛋白質(zhì)還可進(jìn)一步與巰基反應(yīng)產(chǎn)生分子間二硫鍵和硝?；庪x子(HNO)，化學(xué)反應(yīng)式為:PSNO+PSH→PSSP+HNO[13]。因此，細(xì)胞內(nèi)亞硝基化修飾水平升高可以直接引起靶蛋白發(fā)生亞硝基化(PSNO)，也可以引起靶蛋白之間形成二硫鍵(SS)。這兩種修飾均屬于NO引起的可逆性巰基氧化修飾。DTT是一種特異的巰基氧化修飾還原劑，可以還原 PSNO 或 S － S[5，6，14]。我們在細(xì)胞因子聯(lián)合孵育引起細(xì)胞內(nèi)亞硝基化修飾后，提取核蛋白，與DTT直接反應(yīng)，結(jié)果顯示，DTT逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞因子共孵育對CREB活性的抑制作用。因此，我們認(rèn)為細(xì)胞因子共孵育使細(xì)胞內(nèi)亞硝基化修飾水平升高，導(dǎo)致CREB發(fā)生了可逆性巰基氧化修飾，從而抑制了CREB的活性。

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