卷煙過濾嘴降解菌的篩選及其降解效果的電鏡觀察

孫毓臨，譚 英，劉明洋，劉愛軍，曾清如*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128；2.湖南中煙有限責(zé)任公司長沙卷煙廠，長沙 410128）

我國是世界最大的煙草生產(chǎn)國與消費(fèi)國[1]，巨大的生產(chǎn)量與銷售量，不僅帶來了經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也給環(huán)境帶來污染。數(shù)量龐大的過濾嘴直接進(jìn)入土壤或水體，也給環(huán)境的自我凈化造成了巨大壓力。

自卷煙濾嘴問世 50年來，科研人員做了大量的試驗(yàn)，試圖開發(fā)出更加安全的濾嘴，其關(guān)注焦點(diǎn)一是能從卷煙煙氣中除去更多的有害成分，二是能保持卷煙的煙味[2-3]，對(duì)過濾嘴材料在環(huán)境中的降解及轉(zhuǎn)化行為的研究鮮有報(bào)道。

目前卷煙濾嘴的主要原料是二醋酸纖維[4]，由其做成的卷煙過濾嘴材料，彈性好，無毒無味，熱穩(wěn)定性好，吸阻小，截濾效果顯著，能選擇性地吸附卷煙中的有害成分，同時(shí)又保留了一定的煙堿而不失卷煙口味。二醋酸纖維是葡萄糖單元中的羥基與乙酸發(fā)生了酯化反應(yīng)的產(chǎn)物[5]，要了解卷煙過濾嘴在環(huán)境中的行為，纖維素的降解是關(guān)鍵。纖維素是由葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的線狀大分子聚合物，是地球上最豐富的多糖物質(zhì)，主要是通過微生物分泌的纖維素酶對(duì)其進(jìn)行降解。但由于生產(chǎn)纖維素酶的成本很高、對(duì)環(huán)境很敏感，很難直接應(yīng)用。所以，一般應(yīng)用的是分離篩選得到的纖維素分解菌。目前已有一些關(guān)于分離用于發(fā)酵的纖維素菌的報(bào)道。趙永勛等[6]將分離篩選到的3株酶活力較高的菌株接種到有機(jī)廢棄物堆肥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種菌劑可以加快有機(jī)廢棄物中纖維素的分解并使有機(jī)肥的養(yǎng)分含量迅速提高。馮明謙[7]等分離篩選了芽孢桿菌、霉菌、放線菌，接種后可明顯縮短垃圾堆肥發(fā)酵時(shí)間。對(duì)于不同的分解材料、不同氣候條件、不同發(fā)酵工藝等，纖維素菌種類等的要求也有較大差異，特別是改性纖維素的化學(xué)性質(zhì)與原纖維素相比有很大的不同，對(duì)其被微生物分解的機(jī)理也應(yīng)有所差別。筆者基于生物降解原理，從土壤和不同材料的堆肥中分離篩選出高效穩(wěn)定的纖維素分解菌，利用電子掃描顯微鏡來探討卷煙過濾嘴纖維素的降解過程與機(jī)理，以便用來改良過濾嘴材料，加快卷煙過濾嘴在環(huán)境中的分解過程。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

菌種來源：自然界朽木、半腐枯枝落葉處污泥和溫室大棚周邊的土壤。

供試試劑：KC1，NaC1，K2HPO4，NH4Cl，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H20，瓊脂，蛋白胨，牛肉膏，生理鹽水，丙酮，戊二醛，醋酸異戊酯。

50%膜：為長沙卷煙廠自行研發(fā)的一種改良過濾嘴材料。先用1%醋酸浸泡24 h，用碘液檢查確定無淀粉后，再用 2%蘇打水沖洗至中性，晾干后待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；LDZX-40型不銹鋼立式電熱蒸汽壓力消毒器(上海申安醫(yī)療器械廠)；LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)(長沙市八方科學(xué)儀器有限公司)； ZHWY-2102型雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；PYX-800Q-B型人工氣候箱(廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)；掃描電鏡(日本電子)；電子天平等。

1.3 培養(yǎng)基[8-10]

初選平板培養(yǎng)基、復(fù)選平板培養(yǎng)基及用來保藏菌株的斜面培養(yǎng)基均為普通牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基組成為：KC1 0.5 g， K2HPO42.0 g， NH4Cl 6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H20 痕量，50%膜0.2 000 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。降解培養(yǎng)基組成為基本同富集培養(yǎng)基，50%膜添加量為0.100 0 g。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的篩選與分離純化 從自然界中不同地點(diǎn)采集朽木、土壤、半腐枯枝落葉、污泥等樣品，分別放入三角瓶中，加入適量的無菌水，振蕩 30 min，靜置30 s后取上清液1 mL，分別接種至50mL的富集培養(yǎng)基中。在30 ℃，150 r/min 的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)5 d，再以2%的接種量接入到新鮮的富集培養(yǎng)基中。經(jīng)過 3～5次的富集純化培養(yǎng)，從中選擇纖維素膜條崩潰程度較高、崩潰速度最快和效果穩(wěn)定的富集培養(yǎng)液進(jìn)行菌株分離純化培養(yǎng)。

取0.2 mL 的富集培養(yǎng)液涂布到初篩平板培養(yǎng)基上，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿于 30 ℃的人工氣候箱中靜置培養(yǎng)。待菌種長出后，選取生長快、菌苔厚、未污染的菌落，用劃線法接入到復(fù)篩平板培養(yǎng)基上，并進(jìn)行純化培養(yǎng)，得到可以降解50%膜的兩株純菌株，分別命名為SUN-2和SUN-5，并接入斜面培養(yǎng)后冷凍保藏。

1.4.2 纖維素分解效果的測定 菌懸液的制備：斜面菌種接入富集培養(yǎng)基，于30 ℃，150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，控制OD500為0.500 左右，備用。

對(duì)改性纖維素膜的降解：按 2%的接種量將兩菌株的菌懸液分別接入降解培養(yǎng)基，另設(shè)同條件下加入無菌水的對(duì)照組，每組3個(gè)平行，于30 ℃的人工氣候箱中靜置培養(yǎng)，觀察50%膜的崩解效果。每4 d（即第3,6,9,12,15 天）取出一批樣品。50%膜取出后，先用蒸餾水淋洗浸泡10 min，再于真空干燥箱中干燥 3 d，用萬分之一的天平進(jìn)行精確稱重，根據(jù)50%膜重量的減輕程度，可以判斷出該50%膜的降解程度，同時(shí)對(duì)降解過的50%膜進(jìn)行電鏡觀察。

1.4.3 菌株及 50%膜的掃描電鏡觀察 按照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 降解效果動(dòng)態(tài)

對(duì)分別經(jīng)過SUN-2和SUN-5降解的50%膜進(jìn)行觀察，肉眼可見50%膜上出現(xiàn)崩潰小孔，且有毛邊，同時(shí)培養(yǎng)液中出現(xiàn)粉末狀的纖維，培養(yǎng)液變渾濁，呈乳白色。而對(duì)照組則無此變化。對(duì)降解后的50%膜進(jìn)行稱重，計(jì)算降解率，結(jié)果如圖1所示。

從圖中可以看出，SUN-2和SUN-5對(duì)50%膜的降解率在第三天即能達(dá)到30%以上，說明這種改性纖維素膜具有較好的生物可降解性。但此后，降解率無明顯增長，可能是因?yàn)槭Ｓ嗟牟牧蠠o法被菌株利用或者利用率較低。

圖1 SUN-2和SUN-5對(duì)50%膜的降解率Fig.1 Degrading ratio of SUN-2 and SUN-5

2.2 50%膜降解前后的掃描電鏡觀察

2.2.1 50%膜降解前的掃描電鏡觀察 圖2為50%未被降解時(shí)的掃描電鏡圖片。從圖中可知，50%膜在未降解前，其表面較光滑，部分區(qū)域相對(duì)粗糙，有泡狀或者片狀突起。

圖2 50%膜降解前電鏡掃描所見表面Fig.2 SEM image of 50% film before degraded

2.2.2 50%膜被 SUN-2降解后的掃描電鏡觀察圖3是經(jīng)過菌株SUN-2的降解后50%膜的掃描電鏡圖片，對(duì)比50%膜未被降解時(shí)的圖片可知，50%膜表面已經(jīng)遭受了侵蝕，由相對(duì)光滑變得非常的粗糙，整片50%膜出現(xiàn)不規(guī)則裂痕，有小塊的50%膜已經(jīng)被菌株降解而脫離下來，使50%膜表面出現(xiàn)明顯的凹凸不平。

2.2.3 50%膜被SUN-5降解后的掃描電鏡觀察 圖4是SUN-5降解后50%膜的掃描電鏡圖片，對(duì)比圖1可知，50%膜表面出現(xiàn)了水紋狀裂痕，說明菌株對(duì)50%膜具有一定的降解效果。另外，對(duì)比圖3可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過菌株SUN-2降解過的50%膜，其粗糙程度要高于菌株SUN-5降解過的50%膜，說明菌株SUN-2對(duì)50%膜的降解作用要比SUN-5強(qiáng)。

圖3 SUN-2降解兩周后電鏡掃描所見50%膜表面Fig.3 SEM image of 50% film degraded by SUN-2

圖4 SUN-5降解兩周后電鏡掃描所見50%膜表面Fig.4 SEM image of 50% film degraded by SUN-5

2.3 菌株的掃描電鏡觀察

2.3.1 菌株 SUN-2的掃描電鏡形態(tài)特征 通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：菌株SUN-2形成的菌落呈圓形，米白色，表面較干燥，易挑起。圖5為SUN-2的掃描電鏡照片，從照片可以看出，菌株細(xì)菌呈球狀，無鞭毛，大小較均勻，分布較分散，菌體表面粗糙，全部為單生，沒有對(duì)生、鏈生形式的細(xì)菌，且在菌株SUN-2中沒有發(fā)現(xiàn)單層細(xì)菌成群排列。

圖5 單生的SUN-2菌株Fig.5 The solitary form of SUN-2

2.3.2 菌株 SUN-5的掃描電鏡形態(tài)特征 通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，菌株SUN-5形成的菌落呈圓形，隆起，橙黃色，邊緣光滑整齊，黏稠易挑起。圖6為SUN-5的掃描電鏡照片，從照片可以看出，菌株細(xì)菌呈橢球型，無鞭毛，大小較均勻，但體積比SUN-2小。菌體表面光滑，一端較另一端圓鈍或靠近一端有帶狀突起。菌株SUN-5分布較集中，大部分為鏈生，有少量單生菌存在，且大部分的鏈生菌株以4個(gè)菌株組成的細(xì)菌鏈存在，有少量細(xì)菌對(duì)生。

圖6 鏈生的SUN-5菌株Fig.6 The chain form of SUN-5

3 小 結(jié)

1) 從自然界中不同地點(diǎn)采集到的朽木、土壤、半腐枯枝落葉、污泥等樣品中分離到兩株對(duì)50%膜有較強(qiáng)降解效果的細(xì)菌，分別命名為 SUN-2和SUN-5。對(duì)兩株菌種進(jìn)行了電鏡掃描，照片顯示兩株菌皆為球型菌，無鞭毛；SUN-2單生，菌體表面粗糙；SUN-5鏈生，菌體表面光滑。

2) 通過一組長達(dá)兩周的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，研究SUN-2和SUN-5對(duì)50%膜的降解能力，發(fā)現(xiàn)兩株菌對(duì)該膜的降解率在第3天即能達(dá)到40%，且SUN-2對(duì)50%膜的降解作用要比SUN-5強(qiáng)。之后繼續(xù)培養(yǎng)未見降解率有明顯的增長，初步分析可能是該膜剩余材料不易被單種菌株降解。

3) 對(duì) 50%膜降解前后的電鏡觀察可以很明顯地看到，經(jīng)過菌種降解后的50%膜，其表面都遭受了不同程度的侵蝕，由光滑變得非常的粗糙，產(chǎn)生不同程度的裂縫或凹槽，說明菌種對(duì)該膜的結(jié)構(gòu)起到了一定的破壞作用。

4) 在此基礎(chǔ)上，可對(duì)50%膜進(jìn)行再次改良，使其更易于被土壤中的土著微生物降解，以最大限度地降低卷煙過濾嘴對(duì)環(huán)境造成的污染，提高產(chǎn)品的市場競爭力。

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