HPLC法測(cè)定消癖顆粒中淫羊藿苷的含量

劉海敬

（廣州奇績(jī)醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州 510620）

消癖顆粒具有補(bǔ)腎活血、化痰散結(jié)、調(diào)攝沖任等功效，主要應(yīng)用于治療乳腺增生病痰瘀互結(jié)、沖任失調(diào)證。其處方由淫羊藿、肉蓯蓉、郁金、莪術(shù)、制何首烏等組成。淫羊藿作為消癖顆粒處方中的君藥，而且用量較大，淫羊藿為其代表性有效成分?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，淫羊藿能增強(qiáng)心腦血管血流量，促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功能。淫羊藿的主要活性成分為淫羊藿苷。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、影響內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)等多種重要的生物活性[1]。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用HPLC法測(cè)定淫羊藿苷含量，以此作為該藥的質(zhì)量控制定量指標(biāo)[2-6]。

1 儀器與試藥

安捷倫1100型（安捷倫科技有限公司）；消癖顆粒（廣州奇績(jī)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：09090101、09090102、09090103）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）；乙腈（德國(guó)默克公司，色譜純）；甲醇（德國(guó)默克公司，色譜純）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水（26.3∶73.7）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃。根據(jù)淫羊藿苷峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不得低于1500，分離度大于1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取經(jīng)105℃干燥至恒重的淫羊藿苷對(duì)照品約6 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加50%甲醇約90 ml，超聲處理5 min使溶解，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取5 ml置10 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為30 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品研細(xì)約1 g，精密稱定，置250 ml圓底燒瓶中，加50%甲醇約 90 ml，加熱回流提取2 h，取出，放冷，濾過，置100 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照液的制備

按照消癖顆粒處方自制不含淫羊藿的陰性供試品，再按照供試品溶液的處理方法制備，即得陰性溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

按照上述色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置有吸收峰；而陰性對(duì)照溶液色譜圖在淫羊藿苷峰位置處無吸收峰出現(xiàn)，表明在此色譜條件下，供試品中其他成分對(duì)淫羊藿苷含量測(cè)定無影響，分離完全。見圖1。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系和標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品9.89 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為 197.8 μg/ml的對(duì)照品溶液。 精密吸取 0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0 ml對(duì)照品溶液至 10 ml量瓶中，以流動(dòng)相稀釋定容至濃度為 9.89、19.78、39.56、79.12、98.9、118.68、158.24 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，各取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以淫羊藿苷峰面積A為橫坐標(biāo)，濃度C為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=16.377C-3.4987（r=0.9998），結(jié)果表明，淫羊藿苷在9.89～158.24 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察（n=7）Tab.1 The investigation on line ralationship(n=7)

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，求得RSD值，結(jié)果表明，RSD＜2%，結(jié)果表明儀器精密度良好。見表2。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)同一供試品溶液分別于制備后0、2、4、8、12、24 h測(cè)定淫羊藿苷峰面積，RSD=0.09%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。見表3。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批樣品，按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定含量并計(jì)算，RSD＜2%，結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好。見表4。

表2 精密度試驗(yàn)（n=6）Tab.2 Precision test(n=6)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.3 Stability test

表4 重復(fù)性試驗(yàn)Tab.4 Repeatability test

2.6.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取制劑，配制成約為50 μg/ml的母液，精密稱取不同量淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品各3份，置10 ml量瓶，每瓶加入1 ml母液，流動(dòng)相稀釋定容，照含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，由測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率。平均回收率為（100.15±0.44）%，RSD 為 0.44%。 結(jié)果見表 5。

表5 回收率試驗(yàn)Tab.5 Results of recovery test

2.7 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，按照供試品的制備方法制備成供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.6 Content determination results of samples （%，n=3）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選定

由紫外吸收?qǐng)D譜可見，淫羊藿苷在270 nm和219 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，以270 nm靈敏度最高，與《中國(guó)藥典》中測(cè)定波長(zhǎng)一致[7]；而219 nm易受甲醇溶劑峰的影響，故確定270 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)曾采用不同比例的乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[8]，結(jié)果以乙腈-水（26.3∶73.7）為流動(dòng)相時(shí)淫羊藿苷吸收峰與雜質(zhì)吸收峰均能得到較好的分離，且其保留時(shí)間和完成樣品分析時(shí)間較為合適，故定為流動(dòng)相。

3.3 提取條件優(yōu)化

消癖顆粒是由10味中藥經(jīng)過提取后精制而成，成分較多，實(shí)驗(yàn)分別用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇為提取溶媒進(jìn)行回流提取，結(jié)果以50%甲醇的提取量較高，且水溶性雜質(zhì)干擾較少。用50%甲醇回流提取2 h，樣品中淫羊藿苷已基本提取完全。

本文對(duì)HPLC法測(cè)定消癖顆粒中淫羊藿苷的含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明HPLC法簡(jiǎn)便、靈敏、分離效果好，不受雜質(zhì)影響。試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于消癖顆粒的質(zhì)量控制。

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