外陰惡性腫瘤中P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18的檢測及意義

李勝水 ，葛風芹 ，劉春在 ，許 華 ，李雙標 ，張鳳梅 ，劉 巖

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，河北滄州 061001；2.河北省滄州市傳染病醫(yī)院，河北滄州 061001；3.河北省南大港醫(yī)院，河北滄州 061103)

研究表明，外陰多種病變與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關(guān)，高危HPV感染則是引起外陰惡性腫瘤的重要原因之一[1]。在外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，HPV感染與P21、ILK蛋白過度表達是否存在一定的聯(lián)系，目前國內(nèi)文獻報道較少。本研究通過免疫組化SP法及原位雜交法（ISH）檢測P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18在外陰惡性腫瘤、外陰上皮內(nèi)瘤變（VIN）組織中的表達情況，進而綜合分析在不同HPV感染的狀態(tài)下，P21和ILK的表達與外陰惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系，有助于全面理解外陰惡性腫瘤的生物學特征，為臨床診斷、治療及判斷預后提供有價值的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標本取自1992～2009年滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院因外陰病變而行手術(shù)切除的患者，入院后均行外陰廣泛切除術(shù)加腹股溝盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。外陰惡性腫瘤30例，其中，腺癌2例，基底細胞癌2例，外陰鱗癌26例（角化鱗癌21例，疣狀鱗癌5例）；癌組織高分化11例，中分化12例，低分化7例；病理分級G119例，G26例，G35例；腫瘤直徑≤2 cm者8例，＞2 cm者22例。全部病例術(shù)前均無放療、化療史；病程1～5年；年齡30～83歲，平均56.5歲。外陰上皮內(nèi)瘤變（VIN）21例，其中，VINⅠ 6例，VINⅡ 8例，VINⅢ 7例；年齡30～71歲，平均55.5歲。10例正常皮膚組織為對照組，其中，5例為外陰手術(shù)陰性切緣，5例正常外陰組織；年齡35～87歲，平均61.0歲。所有標本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑

一抗分別為鼠抗人P21單克隆抗體，鼠抗人ILK單克隆抗體，HPV 6/11、HPV 16/18原位雜交檢測試劑盒（含生物素標記的HPV 6/11、HPV 16/18探針）和SP試劑盒。以上試劑均購自福州邁新公司。

1.3 實驗方法

P21及ILK檢測采用免疫組化SP法；HPV 6/11及HPV 16/18檢測采用原位雜交法。實驗步驟嚴格按說明書進行。

1.4 結(jié)果判定

P21及HPV 6/11、HPV 16/18均顯示細胞核著色，光學顯微鏡下見到細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色；ILK在細胞內(nèi)的陽性表達主要位于腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi)，出現(xiàn)淺或棕黃（褐）色顆粒。評分方法：參照Fomwitz綜合計分法并略加修改，行半定量分析：隨機抽樣在高倍鏡下計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)和陽性細胞個數(shù)，然后得出陽性細胞百分率，著色強度按多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色程度分為4級：陰性（-），即陽性細胞數(shù)<1%，僅極個別細胞呈現(xiàn)輕度顯色或者無顯色；弱陽性（+），即陽性細胞數(shù)<10%且≥1%；強陽性（+++），即陽性細胞數(shù)>60%；中度陽性（++），即陽性細胞數(shù)介于弱陽性與強陽性兩級之間。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0軟件分析，用行×列聯(lián)表χ2檢驗，各指標的相關(guān)關(guān)系用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 P21及ILK在各組中的表達情況

P21在外陰惡性腫瘤組、VIN組中的陽性表達率顯著高于正常組（P<0.05）；ILK在外陰惡性腫瘤組中的陽性表達率顯著高于VIN組（P<0.05），其在外陰惡性腫瘤組和VIN組中的陽性表達率均顯著高于正常組（P<0.05）。見表1。

表1 P21和ILK在各組中的表達（例）

2.2 HPV 6/11、HPV 16/18在各組中的感染情況

外陰惡性腫瘤組和VIN組中HPV 6/11陽性表達率均顯著高于正常組（P<0.05）；HPV 16/18陽性表達率與正常組比較，有顯著性差異（P<0.05）；VIN組與正常組比較，無顯著性差異（P>0.05）。 見表 2。

表2 HPV 6/11、HPV 16/18在各組中的感染情況

2.3 HPV 6/11、HPV 16/18 與 P21、ILK 的關(guān)系

HPV 6/11、HPV 16/18感染組中P21、ILK的陽性表達與無感染組比較，無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

表3 HPV 6/11、HPV 16/18感染與無感染者P21、ILK的檢測（例）

2.4 P21與ILK、HPV 6/11、HPV 16/18的檢測與外陰惡性腫瘤的臨床病理特征及其相互關(guān)系

P21、ILK和HPV 6/11、HPV 16/18的陽性表達率與腫瘤大小、組織類型、鱗癌的病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)（rs=-0.022，P>0.05）。 HPV 6/11、HPV 16/18 與 ILK 和P21 的表達無相關(guān)性（rs=-0.020，P>0.05），ILK 與 P21 的表達也無相關(guān)性（rs=-0.015，P>0.05）。

3 討論

p21基因是CIP家族中的一員，它是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子。p21可以和p53共同構(gòu)成細胞周期G1檢查站，因DNA損傷后不經(jīng)過修復則無法通過，減少了受損DNA的復制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用[2-3]。p21可以通過細胞周期調(diào)控作用間接參與細胞凋亡（依賴p53途徑）和直接導致細胞異化惡變（非依賴p53途徑），可以正性調(diào)節(jié)細胞依賴性激酶功能，抑制PCNA與多聚酶γ結(jié)合，影響DNA復制和抑制應激蛋白激酶活性，可作為腫瘤分化程度及臨床分期的參考指標之一[4]。

ILK是新近發(fā)現(xiàn)的一個具有3個結(jié)構(gòu)單位的Ser/Thr蛋白激酶，作為整合素和生長因子受體信號傳導途徑中的一個重要效應物，ILK調(diào)節(jié)著細胞的黏著、生存、分化和凋亡[5]。其相關(guān)蛋白PKB、GSK3等是細胞程序性死亡和細胞周期循環(huán)的重要調(diào)節(jié)蛋白[6-7]。這些原因使得ILK與腫瘤的形成、浸潤、轉(zhuǎn)移和臨床預后等密切相關(guān)。目前，ILK的功能紊亂在腫瘤發(fā)生中的作用仍有大量的理論問題有待解決[8-12]。

本研究結(jié)果表明，在各級VIN中均有P21及ILK表達，且陽性產(chǎn)物定位于非典型區(qū)，推測在異常細胞增殖的轉(zhuǎn)化過程中，已有ILK及p21基因的擴增，并可通過蛋白水平檢測出來。ILK在外陰惡性腫瘤中的陽性表達率明顯高于VIN組，表明從外陰惡性腫瘤癌前病變到浸潤癌的發(fā)展過程中ILK起重要的作用；而P21在外陰惡性腫瘤組與VIN組中的陽性表達率相似，推測在外陰惡性腫瘤的發(fā)展過程中P21的檢出可能是一個早期事件。

本研究結(jié)果顯示，P21及ILK陽性表達與外陰惡性腫瘤的臨床分期、組織學分級、腫瘤的大小及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均無關(guān)，提示在外陰惡性腫瘤中，P21和ILK的過度表達可能只對細胞轉(zhuǎn)化及惡性表型的維持有重要作用，而與外陰惡性腫瘤的預后無關(guān)。P21與ILK表達無相關(guān)性，推測在外陰惡性腫瘤中ILK的表達可能還受其他因素的影響。約1/3的外陰惡性腫瘤與HPV感染有關(guān)，在小于35歲的婦女中HPV感染率高達85%。本研究結(jié)果表明，在外陰惡性腫瘤及VIN組織中存在一定比例的HPV 6/11及HPV 16/18感染，推測HPV感染在外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起一定作用。同時，本研究結(jié)果顯示，HPV 6/11、HPV 16/18 感染與 P21、ILK的表達無關(guān)。

總之，外陰組織的癌變是受多種因素作用的，筆者認為通過降低HPV感染率，對P21、ILK蛋白表達陽性的癌前病變積極干預，可以遏制細胞的持續(xù)轉(zhuǎn)化，從而在一定程度上阻止外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

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