箬竹提取物抑菌活性研究

張 慧，林海萍，盛恩浩，厲 亮，胡樹恒，毛勝鳳*

（1. 浙江省臨安市林業(yè)科學(xué)研究所，浙江 臨安 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省臨安市林業(yè)局，浙江 臨安 311300；4. 浙江省臨安市昌化林業(yè)站，浙江 臨安 311300；）

隨著人們生活水平的不斷提高，對食品提出了更高的要求，食品工業(yè)因此獲得了迅猛的發(fā)展。食品工業(yè)的關(guān)鍵問題之一是防腐保鮮，延長保存期，添加防腐劑是其重要措施之一。天然食品防腐劑作為一類新型安全高效的防腐劑，已成為食品科學(xué)研究的熱點之一，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用動物、植物、微生物或其代謝產(chǎn)物等為原料，經(jīng)提取、酶法轉(zhuǎn)化或者發(fā)酵等技術(shù)生產(chǎn)的天然抗菌物質(zhì)會越來越多[1～2]。天然食品防腐劑也是今后防腐劑市場的主要方向。

竹葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，是中醫(yī)一味著名的清熱解毒藥[3]。最新的研究結(jié)果表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用[4]。國內(nèi)外竹葉系列產(chǎn)品已上市，將其制成片狀、粉劑、膠囊以及飲料等降血脂、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、清熱解毒、抗菌防癌等藥品、功能性食品及食品添加劑[5]。竹葉是一種比銀杏葉資源量大而廉價的林業(yè)資源，前景廣闊，但目前應(yīng)用較少，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。

本研究以箬竹（Indocalamus tessellatus）葉水提取物和丙酮提取物對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、八疊球菌（Sarcina）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）的抑菌活性進(jìn)行研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、八疊球菌、黑曲霉、青霉、木霉菌種均來自浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院森林保護(hù)實驗室。

1.1.2 主要儀器 JASON-1型真空泵（美國GAST）；303A-4型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（南京大冉科技有限公司）；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001S型（日本Eyela）；FA1004型電子天平（南京東邁科技儀器有限公司）；FK-A組織搗碎機(jī)（金壇市晶玻實驗儀器廠）。

1.1.3 主要試劑 牛肉膏（分析純）、蛋白胨（分析純）、氯化鈉（分析純）、蔗糖（分析純）、瓊脂條（食品級）、丙酮（分析純）、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉（分析純）、蒸餾水（實驗室自制）等。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

制作方法：在鍋內(nèi)加水1000 mL，放入牛肉膏3 g、蛋白胨10 g和氯化鈉5 g，放在電爐上加熱。待燒杯內(nèi)各組分溶解后，加入瓊脂15 g，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補(bǔ)足失水，用1 mol/L鹽酸或1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)整pH值到7.2 ～ 7.6，分裝于不同試管，加棉花塞，用高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4.2 霉菌培養(yǎng)基

霉菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

制作方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，再加10 ～ 20 g葡萄糖和17 ～ 20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，所得濾液分裝于不同試管，加棉花塞，高壓蒸汽滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

實驗流程：新鮮竹葉→組織搗碎機(jī)搗碎→加入丙酮或水→常溫浸泡48 h→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→溶劑再提取→濃縮液（竹葉防腐劑）。

竹葉丙酮提取液制備：取5 kg的箬竹葉，洗凈晾干用搗碎機(jī)搗碎，盛于不銹鋼桶中，加入丙酮（20 L），浸泡48 h得竹葉原提取液。過濾提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，提取溫度控制在38 ～ 48 ℃，然后再用丙酮溶劑提取1次，得實驗用原液。

竹葉水提取液制備：取5 kg的箬竹葉，洗凈晾干后用搗碎機(jī)搗碎，盛于不銹鋼桶中，加入蒸餾水（20 L），浸泡48 h得竹葉原提取液。過濾提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，提取時溫度控制在50 ～ 60 ℃，再用蒸餾水提取1次，得實驗用原液。

1.3 抑菌試驗

1.3.1 抑菌圈試驗 抗菌試驗采用濾紙片法，操作步驟如下：

1.3.1.1 菌懸液的制備 試驗菌從 4 ℃冰箱中取出后，接種在新鮮斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、八疊球菌）經(jīng)37℃、24 h，霉菌（黑曲霉、木霉、青霉）經(jīng)28 ℃、24 h恒溫培養(yǎng)活化后，用無菌生理鹽水制備菌原液。吸取l.00 mL菌原液加入9.00 mL無菌生理鹽水中，得到稀釋10倍的菌懸液，依次進(jìn)行梯度稀釋。將不同稀釋度的菌懸液各吸取0.20 mL分別加入到已滅菌冷卻的各自適宜的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻。按上述條件培養(yǎng)，根據(jù)觀察結(jié)果，選取各自適宜的菌液濃度，要求在該濃度下，菌能長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻。

1.3.1.2 濾紙片的制備 用打孔器將102型新華濾紙制成直徑為5 mm的圓片，放入干燥潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)121℃熱滅菌30 min，浸入各提取液及相應(yīng)的提取溶劑中，1 h后取出，無菌條件下晾干備用。

1.3.1.3 抑菌活性測定[6]對細(xì)菌，用無菌吸管吸取各自適宜濃度的菌懸液0.2 mL加在已倒好的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻；對霉菌，用無菌棉簽蘸取霉菌孢子懸液，均勻地涂布在已倒好的平板培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放到上述含菌平皿上，每皿3片，細(xì)菌經(jīng)37℃、24 h，霉菌經(jīng)28℃，48 h培養(yǎng)后，量取抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑作為竹葉抑菌活性指標(biāo)，直徑越大抗菌活性越強(qiáng)。

對照組制備：在已涂布好菌液的培養(yǎng)基上放上消毒好的濾紙片，作為空白對照組，每皿對照3片；將消毒過的濾紙片用丙酮處理，放在已涂布好菌液的培養(yǎng)基上，每皿3片作為丙酮培養(yǎng)基。

1.3.2 最小抑制濃度（MIC）試驗 用兩倍稀釋法將竹葉防腐劑稀釋成不同濃度，在各平皿中分別加入2 mL稀釋液和20 mL已熔化的培養(yǎng)基，充分混勻。冷卻凝固后，加入0.2 mL上述菌懸液，涂勻，培養(yǎng)。觀察結(jié)果，以不長菌的竹葉防腐劑的最低濃度為最小抑制濃度（MIC）[7]。

1.3.3 竹葉防腐劑的食物防腐試驗 將不同濃度竹葉抽提液作為抑菌劑加入果品及豆腐干中，自然條件下放置。隔天檢查果品的保存情況，查看是否有變質(zhì)情況；每天對處理過的豆腐干進(jìn)行檢查，做出感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈測定結(jié)果

由表1可以看出，箬竹竹葉提取物對細(xì)菌都有一定的抑菌效果。箬竹丙酮提取物對大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到12 mm，相對于試劑對照組也大4 mm多，水提物的抑菌圈直徑也達(dá)到了10 mm，說明竹葉提取物對大腸桿菌的抑菌效果是比較明顯的，且受不同試劑提取的影響較小?？莶菅挎邨U菌和八疊球菌的丙酮提取物相對于對照組抑菌圈都只大了1 mm左右，但水提物對八疊球菌的抑制作用則很明顯，達(dá)到了20 mm左右，說明不同提取試劑對其影響較大。兩種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都在9 ～ 10 mm，說明該菌對提取試劑的影響較小。霉菌的抑菌圈大小變化不大，說明提取液對霉菌的抑菌效果與提取試劑的關(guān)系不大。

從兩種提取液的對這幾種菌的抑菌效果試驗的結(jié)果可以得出，菌種不同，提取液不同，抑菌效果也有比較大的差異。

表1 箬竹丙酮、水提取物抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Acetone and water extracts of antibacterial of In. tessellates mm

2.2 最小抑制濃度

將濃縮物按2倍稀釋法稀釋，得到表2最小抑制濃度數(shù)據(jù)，其中大腸桿菌的兩種提取液都是稀釋到濃縮液的 0.781%得到最小抑菌濃度，其他幾種細(xì)菌的兩種提取物都差不多，最小抑制濃度都不超過濃縮液的3.125%，表明箬竹葉的提取物在比較低的濃度下能抑制一些常見食品腐敗細(xì)菌。由幾種霉菌的測試結(jié)果表明提取物對霉菌的最小抑制濃度要高于細(xì)菌，并且水提物的最小抑菌濃度普遍高于丙酮提取物，說明丙酮作為提取試劑要比水的效果好很多，但是從成本和安全考慮水要廉價和安全許多。

表2 最小抑制濃度（濃縮液＝100%）Table 2 Minimum inhibitory concentration(concentrated liquid = 100%) %

2.3 食物防腐試驗

由表3可知，對蘋果的保鮮效果最好，箬竹提取物處理比自然放置時間長了一倍；香蕉的保存時間比較短，只比對照組多幾天；葡萄的保存時間水提物比對照組時間長了一倍，丙酮提取物只長了3 d；橘子的保存時間2種提取物處理差不多，都比原始放置下長了10 d左右。

將豆腐干經(jīng)過水、丙酮、箬竹的丙酮提取物和水提取物處理后放在20℃下保存，每天對其作感官評價，結(jié)果如表4所示。

表3 提取物對果品的保鮮時間Table 3 Preservation time for fruit of extracts d

表4 提取物對豆腐干的保鮮感官評價Table 5 Sensory evaluation on dried Doufu kept by extract

由表4可知，兩種提取物對豆腐干的保鮮效果都很明顯，并且丙酮提取物的保鮮效果比水提取物要好。相對于貝殼煅燒物處理的豆腐干的防腐作用，竹葉提取物處理的抑菌時間更長，對食品的腐敗變質(zhì)的抑制效果更好[8]。

3 結(jié)論與討論

（1）箬竹葉提取物對霉菌的抑制作用不是很好，對木霉的抑制作用最差。丙酮提取物對大腸桿菌、水提物對八疊球菌的抑制作用最好。

（2）使用竹葉提取液對幾種菌的最小抑制濃度的試驗表明，相比其他防腐劑其用量少而效果好。

（3）竹葉成分復(fù)雜，其抗菌成分及抗菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。一般認(rèn)為竹葉防腐成分可能是對苯二醌及其衍生物、多糖類、黃酮及其酚類[9]。

（4）在果品應(yīng)用上竹葉提取物有較好的防腐保鮮作用，這為竹葉防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。特別是對于一些熱敏性食品，由于其在高溫高壓下殺菌易導(dǎo)致食品品質(zhì)、風(fēng)味、營養(yǎng)等的嚴(yán)重破壞，可通過在其中加入竹葉提取液，避免高溫高壓處理，達(dá)到既防腐又保證食品品質(zhì)、風(fēng)味與營養(yǎng)的效果。

（5）目前在竹葉防腐劑提取方法上還有待更好的完善，尋找一種更簡便高效，且成本低廉的提取方法將為竹葉防腐劑的開發(fā)提供更為有利的條件。

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