良性前列腺增生線粒體DNA控制區(qū)突變

張 濤 ，董子明，熊建榮，劉學進

（1.河南省平頂山煤業(yè)集團總醫(yī)院泌尿外科，河南平頂山 467000；2.鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理教研室，河南鄭州 450052）

人類線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）是由16569個堿基對組成的雙鏈閉環(huán)結構，編碼與氧化磷酸化相關的2種rRNA、22 種 tRNA 和 13 種蛋白多肽基因[1]。nt16024～nt16569、nt1～nt575的非編碼區(qū)共有1120堿基對，稱為控制區(qū)（control region，D-loop），其中含有重鏈復制起點和啟動子等重要基因，調控mtDNA的復制和轉錄[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞和衰老的組織細胞中，存在mtDNA的突變。因此，mtDNA尤其是D-loop的突變正逐漸成為腫瘤和老年病研究者關注的熱點[3]。本文旨在探討良性前列腺增生（BPH）細胞mtDNA控制區(qū)的突變及其意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機選擇我院2004年5月～2005年2月行開放手術切除和電切除的BPH患者22例，年齡54～86歲，平均70歲；6例合并高血壓病、冠心病，2例合并糖尿病，2例合并肺結核。 切除的前列腺重 25～225 g，平均（63.0±40.2） g，均經(jīng)病理檢查證實為BPH。每個患者無菌條件下留取0.1 g BPH標本1份于液氮中保存?zhèn)錂z。同時每個患者抽取靜脈血3 ml，分離出淋巴細胞于液氮中保存?zhèn)錂z。對照組為本地正常成年人10例，年齡 23～35歲，平均 28歲，前列腺重均＜20 g，病理檢查證實為正常前列腺。每人取0.1 g前列腺組織1份于液氮中保存?zhèn)錂z。

1.2 材料

引物：MT-DNA擴增引物，參照GenBank J01415序列設計 2 對引物，MTP1：5'-CAT TAG CAC CCA AAG CTA AG-3'（15981～16000）；MTP2：5'-TAG GCT TTA TGA CCC TGA AG-3'（16530～16511），擴增長度 550 bp；MTP3：5'-GCT AAA GTG AAC TGT ATC CG-3'（16477～16496）；MTP4：5'-TGG GGT GAT GTG AGC CCG TC-3'（622～641），擴增長度734 bp；克隆鑒定引物，T7：5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'；SP6：5'-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'，由生工公司合成，PAGE純化。

1.3 方法

1.3.1 標本DNA提取 組織塊取10～15 mg，外周血檸檬酸鹽抗凝，淋巴細胞分離液分離出白細胞，然后用Qiagen公司QIAamp DNA Micro kit提取MT-DNA，按照說明書操作。

1.3.2 MT-DNA PCR擴增 擴增反應體積為 30 μl，10× 緩沖液 3 μl，5 mmol/L 4× dNTP 2 μl、引物 MTP1、MTP2（或 MTP3和 MTP4）各 0.5 μl，Promega 公司高保真 Taq 酶 2 U，上步提取的 MT-DNA 5 μl，去離子水補足 30 μl。 94℃預變性 180 s，94℃變性 40 s，55℃復性 40 s，72℃延伸 50 s，擴增 30 個循環(huán)。

1.3.3 電泳分析 取擴增產(chǎn)物10 μl，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，256 nm紫外燈下觀察結果，在550 bp和734 bp處出現(xiàn)條帶為MT-DNA基因擴增產(chǎn)物，照相。

1.3.4 MT-DNA與pGEM-T的重組 用膠回收試劑盒（德國Qiagen公司）回收M-DNA 550 bp和734 bp基因片段；回收的目的基因與pGEM-T連接，4℃過夜，轉化入JM109，藍白篩選得到陽性克?。╬GEM-T-MT1和pGEM-T-MT2）。

1.3.5 重組子的PCR鑒定 選取平板上生長的白色菌落為陽性菌落，轉種于 AMP+的 LB平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，取少量菌苔溶于去離子水 50 μl中，100℃水浴 10 min，10000 r/min離心5 min，取上清5 μl用克隆鑒定引物T7和SP6進行PCR擴增。

1.3.6 DNA序列分析 對鑒定正確含有pGEM-T-MT1和pGEM-T-MT2的宿主菌培養(yǎng)擴增，提取重組質粒pGEM-T-MT1和pGEM-T-MT2，對插入序列進行DNA測序，測得數(shù)據(jù)用DNASIS、OMIGA軟件進行比對分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

組間比較用方差分析，突變堿基數(shù)與年齡和前列腺重量的關系用直線回歸t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增MT1和MT2電泳結果

預計MT1 PCR擴增片段為550 bp，MT2 PCR擴增片段為734 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，MT1擴增片段位于500 bp與750 bp之間，且接近500 bp MT2擴增片段位于500 bp與750 bp之間，且接近750 bp，與預期結果一致。見圖1、2。

2.2 重組克隆pGEM-T-MT1、pGEM-T-MT2的篩選與鑒定結果

由于pGEM-T多克隆位點兩側分別存在T7和SP6啟動子序列，因此可以用T7和SP6為引物對載體pGEM-T的多克隆位點是否插入外源基因序列進行PCR篩選鑒定。因此，擴增產(chǎn)物為550+170 bp和734+170 bp的即鑒定為正確重組的 pGEM-T-MT1和 pGEM-T-MT2。 見圖 3、4。

圖1 PCR擴增MT1電泳結果Fig.1 Result of PCR amplification MT1 electrophoresis

圖2 PCR擴增MT2電泳結果Fig.2 Result of PCR amplification MT2 electrophoresis

圖3 重組克隆pGEM-T-MT1鑒定結果Fig.3 Result of recombination clone pGEM-T-MT1

2.3 Mt-DNA序列分析結果

圖4 重組克隆pGEM-T-MT2鑒定結果Fig.4 Result of recombination clone pGEM-T-MT2

與劍橋標準序列比較，22例BPH患者，個體的BPH細胞mtDNA 控制區(qū)變異的堿基對有 3～16 個[平均（7.36±3.70）個]，分布于52個位點上，這些變異分為兩種類型，第一種僅存在于BPH細胞的變異，即突變的堿基對有0～9個[平均（3.14±2.90）個]分布于27個位點上；第二種BPH細胞與淋巴細胞同樣變異的堿基對有 1～8 個[平均（4.23±1.69）個]分布于 27 個位點上。見表1。

表1 BPH線粒體DNA突變Tab.1 BPH mt DNA mutation

在22份BPH組織中，檢測到18份有mtDNA控制區(qū)突變，因此，BPH細胞mtDNA控制區(qū)的突變率是81%（18/22），突變頻率為2.4%（27/1120）。這些突變74%集中在第一高變區(qū)（HVⅠ）和第二高變區(qū)（HVⅡ），其中有11個位于微衛(wèi)星不穩(wěn)定區(qū)。突變方式多為點突變，包括轉換和顛換，2個位點是缺失。突變堿基數(shù)與患者年齡和增生前列腺重量均無相關關系（P＞0.05）。由于人類mtDNA具有高度多態(tài)性，本研究選擇10份正常前列腺作為對照。10份正常前列腺細胞mtDNA控制區(qū)有 3～7 個[平均（4.60±1.49）個]堿基對變異，分布于 12 個位點上。見表2。

表2 10例正常前列腺mtDNA變異情況Tab.2 Polymophisms of 10 cases normal prostate mtDNA

正常前列腺細胞mtDNA控制區(qū)和BPH第二種類型變異的堿基對數(shù)和位點相近，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明第二種類型變異是正常多態(tài)性，多態(tài)性類型與北京地區(qū)的報道相近[4]。

3 討論

線粒體是細胞的能量代謝場所，在進行氧化磷酸化時產(chǎn)生大量的氧自由基，對缺乏組蛋白的保護、直接暴露于線粒體中的線粒體DNA有損傷作用，而線粒體DNA的損傷修復系統(tǒng)又不完善，因此表現(xiàn)出非常高的突變率，文獻報道線粒體DNA的突變率比核DNA高幾十倍，尤其在控制區(qū)，突變率更高[5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤、癌前增生性病變和衰老組織中存在mtDNA的突變，F(xiàn)liss等[6]報道了一些腫瘤mtDNA控制區(qū)的突變率：膀胱癌28.6%、肺癌38.5%、卵巢癌32%和頭頸部腫瘤23%。值得注意的是，Junjian等[7]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和癌前病變上皮內(nèi)瘤（PIN）中mtDNA控制區(qū)突變率高達87.5%，突變頻率達3%。

筆者發(fā)現(xiàn)BPH細胞mtDNA控制區(qū)的突變率為81%，突變頻率為2.4%。大部分集中在HVⅠ和HVⅡ，突變類型多為點突變，包括轉換和顛換，2個位點是缺失，比較Junjian等[7]的研究結果后顯示BPH細胞mtDNA控制區(qū)的突變率和突變頻率均與前列腺癌相近。Junjian等[7]還發(fā)現(xiàn)，前列腺癌mtDNA控制區(qū)突變與患者的年齡和腫瘤的分級均沒有明顯關系，本研究也顯示BPH細胞mtDNA控制區(qū)突變與患者的年齡和前列腺增生的重量沒有相關性；而且也不波及外周血淋巴細胞。BPH細胞mtDNA控制區(qū)突變與腫瘤一樣都是以點突變?yōu)橹?，但與腫瘤的突變位點卻不一致。腫瘤細胞mtDNA在H鏈復制起點區(qū)域存在較多C→T突變，這種突變將降低該區(qū)的GC含量，導致mtDNA復制失控[8]。本研究結果顯示，BPH細胞mtDNA控制區(qū)這種突變很少，這可能解釋為什么BPH與惡性腫瘤的生物學行為不同；關于mtDNA突變的意義，有學者認為只是隨機的改變，對疾病并無影響；但在腫瘤細胞，有學者研究認為mtDNA突變的基因片段能夠游走并且整合到核基因組而誘發(fā)癌變[9-10]；而在衰老組織中，mtDNA突變的熱點是編碼區(qū)，該區(qū)往往存在長片段缺失。由于mtDNA編碼的都是與氧化磷酸化有關的RNA和蛋白多肽，當缺失比率達到一定閾值后導致線粒體能量代謝和其他功能的異常而誘發(fā)細胞凋亡，進一步引起組織器官功能減退[11-12]。BPH和腫瘤一樣細胞凋亡是減少的，由此看來，BPH的發(fā)病不是一個簡單的衰老過程，在mtDNA突變方面與腫瘤有某些相似之處。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BPH細胞mtDNA控制區(qū)存在較高的突變率和突變頻率，這些突變既不隨前列腺增大和增齡而積累，也不波及外周血淋巴細胞，其意義有待進一步研究。

[1]Anderson S,Bankier AT,Barrell BG,et al.Sequence and organization of the human mitochondrial genome[J].Nature,1981,290(5):457-465.

[2]Hao H.Functional and structural features of a tandem duplication of the human mtDNA promoter region[J].Am J Hum Genet,1997,60(6):1363-1372.

[3]Penta JS,Johnson FM,Wachsman JT,et al.Mitochondrial DNA in human malignancy[J].Mutation Res,2001,488(2):119-133.

[4]Young WY,Zhao L,Qian Y,et al.Extremely low penetrance of hearing loss in four Chinese families with the mitochondrial 12S rRNA A1555G mutation[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,328(4):1244-1251.

[5]Johns DR.Mitochondrial DNA and disease[J].N Engl J Med,1995,333(10):638.

[6]Fliss MS,Usadel H,Caballero OL,et al.Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumor and bodily fluids[J].Science,2000,287(5):2017-2019.

[7]Junjian ZC,Neriman G,Graham FG,et al.Extensive somatic mitochondrial mutations in primary prostate cancer using LCM[J].Cancer Res,2002,62(22):6470-6474.

[8]Vijay AV,Chaistopher MC,Karen LA,et al.Non-isotopic in situ hybridization method for mitochondria in oncocytes[J].Histochem Cytochem,1994,42(2):273-276.

[9]Zullos A.Mitochondrial D-loop sequences are integrated in the rat nuclear genome[J].Mol Biol,1991,211(2):1223-1227.

[10]Dombroshi BA.Isolation of an active human transposable element[J].Science,1991,278(3):1805-1809.

[11]Papiha SS,Rathod H,Briceno I,et al.Age related somatic mitochondrial DNA deletions in bone[J].Clin Pathol,1998,51(2):117-120.

[12]Ozawa T.Mitochondrial DNA mutation and age[J].Ann NY Acad Sci,1998,854(6):128-154.