苦參堿對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞株順鉑敏感性的影響及其機(jī)制研究

張繼榮

湖南省腫瘤醫(yī)院（410013）

惡性腫瘤作為一種威脅人類生命健康以及降低生活質(zhì)量的重大疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第3位[1,2]。由于病變部位的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及早期診斷手段的不足，卵巢癌的診治一直都是婦科領(lǐng)域的重要研究課題。盡管腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及聯(lián)合鉑類藥物為基礎(chǔ)化療的綜合治療一定程度上能夠緩解病痛，降低該類腫瘤患者的病死率。但是卵巢癌的復(fù)發(fā)率以及病死率仍然較高。其中，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞耐藥導(dǎo)致的化療失敗是一個(gè)及其重要的原因，也是目前卵巢癌治療面臨的難題之一。相關(guān)學(xué)者也在不斷的尋找增加卵巢癌患者對(duì)于化療藥物的敏感性的方法[3-5]?？鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的活性物質(zhì)，近年來的研究結(jié)果表明苦參堿在抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤細(xì)胞黏附與浸潤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要作用。近年來，調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB以及相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在各種抗腫瘤的輔助治療中的作用引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前的研究已經(jīng)明確，NF-κB的活性增加與參與凋亡抑制蛋白家族成員的表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)。其中Livin以及Survivin兩種最新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子與NF-κB活性間的關(guān)系對(duì)于理解藥物降低上皮細(xì)胞癌發(fā)生率這一現(xiàn)象具有相當(dāng)?shù)睦碚撎接憙r(jià)值[6-8]。介于以上背景，筆者提出通過苦參堿抑制處理上皮性卵巢癌細(xì)胞，通過下調(diào)NF-κB——Livin、Survivin信號(hào)通路，達(dá)到增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于順鉑敏感性的理論設(shè)想。本文旨在探討苦參堿干預(yù)與上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的關(guān)系，以及觀察NF-κB活性、Livin、Survivin表達(dá)量與苦參堿藥物干預(yù)間的聯(lián)系。為上皮性卵巢癌的治療提供借鑒性的信息。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件及傳代

OVCAR細(xì)胞在含10%小牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2d更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞傳代方法：待細(xì)胞生長至培養(yǎng)基底板面積70%～80%，棄培養(yǎng)液，加2～5mL PBS漂洗2次，棄去。加2～3mL胰酶消化3～5min；鏡下看到細(xì)胞收縮變圓，棄消化液，再加3～5mL含小牛血清培養(yǎng)液，用吸管按順序輕輕吹打成細(xì)胞懸液，按照1∶2～3比例進(jìn)行傳代，7℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

噻唑藍(lán)（MTT）（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；NF-κB轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒（Cayman公司）；蛋白提取試劑盒（Active Motif公司）；鼠抗人NF-κB一抗（BD公司）；鼠抗人Livin一抗（Alexis公司）；鼠抗人Survivin一抗（Cell Signaling公司）；羊抗鼠二抗（Sigmal公司）。

1.3 MTT法測定細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后配置成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物處理組（加入順鉑藥物）、細(xì)胞對(duì)照組（不加藥物，只加細(xì)胞懸液）及空白對(duì)照組（加入培養(yǎng)液）。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分別加入0、10、20、25、30、35、40、50和60μmol/L的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)終止前4h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，除去每孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩數(shù)分鐘使形成晶體完全溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測定492nm處吸光度值A(chǔ)492，并計(jì)算該濃度下抑制率，并使用直線回歸法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。存活率＝試驗(yàn)組A492/對(duì)照組A492×100%，抑制率＝1－存活率。

1.4 ELISA法測定NF-κB核DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性

應(yīng)用Cayman公司轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒測定NF-κB核DNA結(jié)合活性。細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入結(jié)合緩沖液90μL以及等量的核蛋白提取液。4℃過夜后用ELISA專用洗液每孔200μL沖洗。加入100μL稀釋后NF-κB一抗，室溫孵育1h，沖洗5次。加入100μL二抗室溫孵育1h，沖洗5次。每孔加入100μL發(fā)光液，室溫避光孵育40min，加入100μL終止液，450nm處讀數(shù)。在陽性對(duì)照正常顯色的前提下，計(jì)算各組樣本吸光度的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)各組OD值進(jìn)行比較。

1.5 Western blot法檢測Livin、Survivin蛋白表達(dá)

總蛋白提取嚴(yán)格按照提取試劑盒說明書操作進(jìn)行。蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)膜法。采用5%脫脂牛奶封閉后，使用TBST洗膜，分別加入各種一抗，4℃過夜后，加入二抗室溫反應(yīng)1h。洗脫后顯影。根據(jù)預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量大小區(qū)域出現(xiàn)的特異性條帶判斷蛋白表達(dá)量的高低。應(yīng)用Bio-Rad公司Quantity-one軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿增加順鉑對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖的抑制作用

上皮性卵巢癌細(xì)胞在苦參堿作用后，對(duì)順鉑的敏感性均有增加，表現(xiàn)為藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)增加，并且這種抑制效應(yīng)隨濃度的增大而增大。其中，順鉑對(duì)10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細(xì)胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對(duì)對(duì)照組細(xì)胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。具體結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度順鉑對(duì)各組細(xì)胞的抑制強(qiáng)度

2.2 苦參堿處理后各組細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性的變化

圖2 Livin在上皮性卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)的灰度分析

NF-κB核DNA結(jié)合活性檢測結(jié)果顯示，苦參堿處理各組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)較對(duì)照組呈現(xiàn)顯著降低，其中苦參堿（10、40、160μmol/L）處理的3組細(xì)胞的NF-κB蛋白表達(dá)分別為（0.507±0.027）、（0.375±0.019）和（0.311±0.017），對(duì)照組NF-κB蛋白表達(dá)為（0.705±0.032）。表明苦參堿處理可以使NF-κB從胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性降低。

2.3 苦參堿處理后各組細(xì)胞中Livin、Survivin蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測結(jié)果顯示，苦參堿作用于卵巢癌細(xì)胞后Livin、Survivin的表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)趨勢，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見圖2。

3 討 論

卵巢惡性腫瘤的病死率居目前婦科生殖道惡性腫瘤病死率的首位，其原因除對(duì)其發(fā)生、發(fā)展過程尚缺乏了解外以及難以早期診斷外，治療過程中及易產(chǎn)生的藥物敏感性降低、腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物耐受現(xiàn)象也是目前臨床一個(gè)棘手的問題。上皮性癌是最為常見的原發(fā)性卵巢癌，主要治療手段是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以鉑類為主的化療。鉑類藥物作為卵巢上皮細(xì)胞腫瘤的一線化療藥物已經(jīng)應(yīng)用40余年，耐藥問題也日益突出，致使患者尤其是晚期腫瘤患者的生存率以及生活質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響。怎樣有效的提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性成為眾多學(xué)者關(guān)注的問題。最近的研究發(fā)現(xiàn)，化療后NF-κB的活化，可以上調(diào)凋亡抑制蛋白，增前凋亡抵抗，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的拮抗作用。這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變可能是腫瘤細(xì)胞化療后藥物敏感性下降的途徑之一?？鄥A作為苦參中的重要活性物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)該成分可以阻止人白血病細(xì)胞的增殖周期，該藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可以導(dǎo)致一些重要的細(xì)胞因子發(fā)生基因、蛋白水平的改變。該藥物的使用是否可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性以及其中潛在的機(jī)制是筆者本次研究探索的目標(biāo)。

本次研究首先觀察苦參堿處理的細(xì)胞是否對(duì)順鉑的敏感性有增加的現(xiàn)象發(fā)生。結(jié)果顯示，順鉑對(duì)10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細(xì)胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對(duì)對(duì)照組細(xì)胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。提示苦參堿能夠有效的增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的敏感性。并且這種增敏現(xiàn)象有著劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB核DNA結(jié)合活性檢測結(jié)果顯示，苦參堿處理各組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)較對(duì)照組呈現(xiàn)顯著降低。該結(jié)果提示，苦參堿的作用可能是與NF-κB介導(dǎo)的凋亡抑制現(xiàn)象有關(guān)。

同時(shí)，本次研究重點(diǎn)關(guān)注NF-κB介導(dǎo)凋亡抑制信號(hào)通路中兩個(gè)重要的蛋白Livin、Survivin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示上述兩種凋亡抑制蛋白的表達(dá)量在苦參堿處理后均呈現(xiàn)明顯的下調(diào)現(xiàn)象。因此，筆者認(rèn)為苦參堿增加上皮性卵巢癌細(xì)胞的敏感性現(xiàn)象可那與其抑制NF-κB活性，阻斷凋亡抑制蛋白Livin、Survivin蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象有關(guān)。

本此研究將NF-κB及其信號(hào)通路為觀察對(duì)象。NF-κB作為一種與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的功能蛋白，研究其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與順鉑藥物敏感性的關(guān)系，對(duì)于我們擴(kuò)展腫瘤治療的思路，預(yù)測細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有著積極的借鑒意義。

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