人臍靜脈血管內皮細胞的高效分離與培養(yǎng)*

張 臣 李 彤 侯躍龍 嚴曉曄 高英堂

人的內皮細胞是血管壁的主要組成部分，在維持組織穩(wěn)態(tài)、纖溶與凝血、血液組織交換、血管舒縮調節(jié)、血管新生、血細胞激活和遷移等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，另外在免疫反應起始過程中也起著決定性的作用[1]。因此體外獲得血管內皮細胞可為闡明許多疾病血管并發(fā)癥的病理過程提供重要研究模型[2]。新生兒臍帶由于取材經濟、來源充足,而成為血管內皮細胞體外獲得的主要材料。本研究旨在建立一種簡單、高效分離培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的方法，為進一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司，中國），明膠（Sigma，USA），M199培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS，Gibico，USA），CD34抗體（Miltenyi Biotec，Germany），人纖維連接蛋白（BD Biosciences，USA），FITC－CD31抗體（晶美生物公司，中國），PE－CD144抗體（eBiosciences，USA），血管性假血友病因子（vWF）抗體（Abcam，England），Dil－標記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-AcLDL,Molecular Probes，USA）。EPICS ALTRA流式細胞儀（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的原代分離及培養(yǎng) 收集2009年2月—2009年7月我院健康產婦剖宮產后的15條臍帶20～30 cm（產婦知情同意），立即放入4℃無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，分離培養(yǎng)在2 h內進行。在無菌條件下剪去破損或有夾痕、血腫部分，用PBS沖洗至靜脈內無血，用止血鉗夾住一端，另一端插管注入0.25%的胰蛋白酶，使之充盈后夾閉臍帶，將其放入無菌容器內，37℃孵育10～15 min。收集消化液和消化后無菌PBS沖洗液，20℃～25℃1 200 r/min離心10 min,棄上清。用5～10 mL含20%血清的M199培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞移入1.5%明膠包被過的培養(yǎng)瓶中，置于37．0℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液，之后隔天換液。

1.2.2 HUVEC傳代培養(yǎng) 原代細胞培養(yǎng)8 d左右，生長達80%～90%融合時進行傳代培養(yǎng)。用PBS沖洗，加入0．25%胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下見細胞變圓、皺縮成團后加入200 mL/L胎牛血清的M199終止消化，用吸管輕輕吹打均勻成細胞懸液，按1∶2接種于培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 HUVEC的鑒定 鏡下觀察細胞形態(tài)，取3代細胞進行表型鑒定和實驗。貼壁內皮細胞用胰酶消化，1×105細胞重懸于50 μL的EP管，分別加入鼠抗人CD144、CD31、CD45、CD34單克隆抗體，陰性對照管不加一抗，室溫閉光孵育30 min，1%多聚甲醛固定。流式細胞儀分析鑒定細胞。vWF抗體在用Trition-X100破細胞膜后加入，余步驟同上。

1.2.4 HUVEC的功能檢測 取1、5代細胞培養(yǎng)6 d后，避光條件下加入濃度為10 mg/L的Dil－AcLDL，37℃孵育24 h。熒光顯微鏡下觀察細胞攝取Dil－AcLDL的情況。

2 結果

2.1 內皮細胞形態(tài)學觀察 消化分離的原代內皮細胞為成團的小圓形細胞，2 h開始貼壁生長，24 h細胞完全貼壁。貼壁細胞呈條索形，7～8 d細胞明顯增多呈漩渦樣生長，此后細胞繼續(xù)增多接近融合呈鋪路石樣改變，見圖1。細胞1∶2傳代培養(yǎng)后，約10 d左右可長滿瓶底達到80%～90%融合，繼續(xù)傳代，傳6代后完成實驗。

2.2 內皮細胞表型及功能鑒定 流式檢測內皮細胞（P3）特異性標志物，高表達CD144（91．52±5．61）%、vWF（85．95±6．14）%、CD31（94．26±3．75）%，部分表達CD34（45．32±4．26）%，CD45表達陰性，見圖2。用Dil－AcLDL與培養(yǎng)的內皮細胞共孵育24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現貼壁細胞中胞漿呈現紅色熒光，而胞核不顯色，證明細胞均攝取Dil－AcLDL（紅色熒光標記蛋白），提示貼壁細胞為有功能活性的內皮細胞，見圖3。

3 討論

HUVEC獲取的方法有機械刮取法[3]、組織塊和酶消化法3種。前2種方法因混雜過多的雜細胞如纖維細胞、血細胞而被后者取代。酶消化法獲取血管內皮細胞可采用胰蛋白酶、膠原酶或混合酶，膠原酶的作用較溫和,消化過程中不易損傷內皮細胞，但價格昂貴、消化時間相對較長;胰蛋白酶消化作用強,對細胞有毒性作用,但其價廉。本實驗采用胰蛋白酶消化法,實驗中筆者將灌注胰酶的臍靜脈兩端封閉后放入37℃溫水中，分別消化25 min、15 min、10 min，發(fā)現消化10 min后獲得的內皮細胞生長活性好，其余消化時間獲得的細胞在培養(yǎng)傳代過程中逐漸失去活性而死亡。因此筆者認為只要掌握最佳消化時間、條件，并及時終止消化,就可以成功獲得足夠多的內皮細胞，這是保證實驗成功的關鍵之一。

HUVEC較動物內皮細胞的培養(yǎng)困難,原代培養(yǎng)不易成功。實驗過程中筆者認為需注意以下幾點：（1）取下的臍帶最好在2 h內將細胞分離完畢,這樣能提高分離細胞的成活率。（2）內皮細胞具有相互接觸促生長作用，因此細胞接種密度不能過低，實驗中發(fā)現當細胞接種密度低于1×105/cm2時內皮細胞增殖能力明顯減弱，傳代后細胞不易成活。（3）采用明膠鋪瓶能夠促使內皮細胞貼壁生長，且細胞形態(tài)伸展良好。（4）傳代時需把握胰蛋白酶的消化時間,防止酶對細胞的損傷。一般在細胞回縮變圓成團時即可終止消化,然后將細胞吹打下來。（5）實驗中發(fā)現,隨著傳代次數的增加,細胞胞漿逐漸減少,胞核逐漸變大，細胞也變得較為扁平似鋪路石樣改變,尤其是傳3代以上與原代細胞區(qū)別甚為明顯，其原因有待進一步探討。（6）在細胞培養(yǎng)過程中有研究者在培養(yǎng)液中加入生長刺激因子來促進細胞生長、貼壁[4-5]，筆者認為這些促進內皮細胞貼壁及生長的刺激因子加入后可能成為影響實驗結果的混雜因素,限制內皮細胞的實驗應用范圍。因此實驗中筆者采用無細胞因子含200 mL/L胎牛血清的M199培養(yǎng)液，發(fā)現內皮細胞生長和形態(tài)正常，并傳5～6代后仍保持內皮細胞功能。

總之，本實驗為體外研究藥物對血管內皮細胞的作用機制以及研究心血管疾病的發(fā)生機制特別是在研究動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素和分子機制提供了可靠的細胞模型，同時也為利用內皮細胞促進人造血管內皮化提供充足的細胞來源，從而提高小直徑人造血管的血液相容性及遠期通暢率。

[1]Yildirim S,Boehmler AM,Kanz L,et al.Expansion of cord blood CD34+hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilic vein endothelial cells(HUVEC)is superior to cytokine-supplemented liquid culture[J].Bone Marrow Transplant,2005,36(1):71-79.

[2]Meng X,Li ZM,Zhou YJ,et al.Effect of the antioxidant alphalipoic acid on apoptosis in human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose[J].Clin Exp Med,2008,8(1):43-47.

[3]Quattrone S,Chiappini L,Scapagnini G,et al.Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture[J].Mol Hum Reprod,2004,10(5):325-329.

[4]Marin V,Kaplanski G,Gres S,et al.Endothelial cell culture:Protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells[J].J Immunol Methods,2001,254(1-2):183-190.

[5]張小燕，梁朝，趙林，等.人臍靜脈內皮細胞分離培養(yǎng)的改進及其鑒定[J].中華醫(yī)學研究雜志，2005，5(6):386-389.