子宮內(nèi)膜癌與胰島素-Ras-MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性研究*

田文艷 竇文婷 王穎梅 張麗志 薛鳳霞 張 灝

子宮內(nèi)膜癌是婦科三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，胰島素抵抗與高胰島素狀態(tài)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。胰島素存在2條信號(hào)通路：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K－Akt）通路及Ras－絲裂原活化蛋白激酶（Ras-MAPK）通路。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。本研究觀察胰島素-Ras-MAPK信號(hào)中的關(guān)鍵分子生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor binding protein 2，Grb-2）、Ras、磷酸化-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（P-ERK）、細(xì)胞周期素D1（CD-1）在正常子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與血清胰島素的相關(guān)性，探討胰島素-Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2004年1月—2007年12月于我院婦產(chǎn)科住院治療患者的石蠟標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療。子宮內(nèi)膜癌（EC）組：51例，年齡32～78歲，平均（56.8±10.1）歲，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌46例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌5例（包括透明細(xì)胞癌1例，漿液性乳頭狀腺癌4例）。根據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)分級(jí)和手術(shù)病理分期。手術(shù)病理分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期4例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例。其中，無浸潤5例，子宮肌層浸潤深度≤1/2者29例，>1/2者17例。病理組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)（高分化，G1）25例，Ⅱ級(jí)（中分化，G2）17例，Ⅲ級(jí)（低分化，G3）9例。子宮內(nèi)膜非典型性增生（AHE）組：10例，患者年齡32～63歲，平均（48.3±10.2）歲。正常子宮內(nèi)膜（NE）組：48例，年齡39～80歲，平均（51.4±10.3）歲，其中分泌期20例，增生期28例，正常子宮內(nèi)膜組織取材于因良性疾患行子宮全切術(shù)的患者。所有標(biāo)本均經(jīng)經(jīng)病理復(fù)查核實(shí)。3組間年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.055，P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 血胰島素水平測定 放免法測定子宮內(nèi)膜癌患者血清胰島素水平（mU/L）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測Grb-2、Ras、P-ERK、CD-1在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，用免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行染色。一抗鼠抗人Ras單克隆抗體，一抗鼠抗人Grb－2單克隆抗體，一抗鼠抗人CD－1單克隆抗體購于美國Santa Cruz生物有限公司。一抗鼠抗人P－ERK單克隆抗體、PV-9000通用型試劑盒DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液代替抗體作陰性對(duì)照，細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染。已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照。高倍鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)不同的視野，各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以每高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)量及染色強(qiáng)度判斷。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽性細(xì)胞染色深淺及陽性細(xì)胞比例打分，細(xì)胞無色為0，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；無陽性細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%以上為3分。累計(jì)積分0～2分為陰性（－），3～4分為陽性（＋），5～6分為強(qiáng)陽性（＋＋）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組資料比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，不同指標(biāo)相關(guān)性運(yùn)用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果Grb-2陽性物質(zhì)均定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿中，見圖1。Ras陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞漿中，見圖2。P-ERK的陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿中，見圖3。CD-1陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核中，見圖4。

2.2 Grb-2、Ras、P-ERK及CD-1在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況Grb-2、P-ERK和CD－1在3組間陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或P＜0．01）；Ras在3組間陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

表1 3組患者子宮內(nèi)膜組織中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1的陽性表達(dá)情況 （例）

2.3 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表達(dá)與血清胰島素以及各指標(biāo)的相關(guān)性Grb-2、P-ERK表達(dá)與血胰島素水平呈正相關(guān)（P＜0．05）。Ras、CD－1表達(dá)與血胰島素水平無相關(guān)性（P＞0．05）。Grb－2與Ras、P－ERK表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），與CD－1無明顯相關(guān)性（P＞0．05），見表2。

表2 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1與血清胰島素以及各指標(biāo)的相關(guān)性 （r）

2.4 不同子宮內(nèi)膜癌患者Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表達(dá)情況 見表3。腫瘤的不同病理分期Grb-2和P－ERK的陽性表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），Ⅱ～Ⅳ期陽性率高于Ⅰ期。在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌中Grb－2陽性表達(dá)比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。其余各指標(biāo)與其他臨床病理因素差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討論

胰島素除調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝外，還可作為生長因子家族中的一員，調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡。胰島素在腫瘤生長調(diào)控中存在2條信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制：PI3K-Akt及Ras-MAPK通路。本課題組前期研究證實(shí)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及組織存在胰島素受體（IR）表達(dá)與活化，通過其下游的PI3K-Akt通路參與腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡[1-2]。但Ras-MAPK途徑研究較少，尤其是在腫瘤組織中的研究，胰島素與IR結(jié)合后，激活的IR可直接使Shc的酪氨酸殘基磷酸化，Shc再與Grb－2結(jié)合，經(jīng)GDP－GTP交換因子激活Ras，進(jìn)而激活Raf－1激酶、MAPK的激酶（MAPKK，也稱MEK），MAPKK磷酸化后激活MAPK。MAPKs家族包括3個(gè)亞族：ERKs、JNKs和p38MAPKs?；罨腗APK可使許多靶蛋白磷酸化，引起多種癌基因及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1等相繼激活，促進(jìn)細(xì)胞分裂[3]。

Grb-2是生長因子-Ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，是Ras上游通路的重要組成部分。Yu[4-5]等研究發(fā)現(xiàn)大腸癌轉(zhuǎn)移灶較原發(fā)灶癌組織高表達(dá)基因有190條，其中轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)的基因中Grb-2的差異最為明顯，達(dá)70倍，Grb-2與腫瘤的生長、浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌Grb-2陽性表達(dá)率升高，表明子宮內(nèi)膜癌存在胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)通路下傳的基礎(chǔ)，Grb-2的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)系。在不同病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌中Grb-2的陽性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Grb-2參與子宮內(nèi)膜癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移。

表3 子宮內(nèi)膜癌組織中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1陽性表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 （例）

Ras癌基因?yàn)樵┗?Ras癌基因的激活是腫瘤發(fā)生的早期事件。本研究中Ras過度表達(dá)與各臨床病理因素?zé)o關(guān)，與本課題組成員于1997年的報(bào)道相同[6]。ERKs為MAPK家族重要成員。Mueller等[7]研究顯示P-ERK在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，P-ERK高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示：P-ERK在子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)過表達(dá)，且不同病理分期間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P-ERK可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程。目前認(rèn)為，CD-1可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G0期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而當(dāng)CD-l表達(dá)失控時(shí)，則將引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Choudhury等[8]研究顯示子宮內(nèi)膜癌CD-1表達(dá)陽性率明顯高于單純性增生子宮內(nèi)膜，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

子宮內(nèi)膜癌三大高危因素肥胖、糖尿病、高血壓，多囊卵巢綜合征（PCOS）患者是年輕子宮內(nèi)膜癌的高危人群。而這些疾病共同的病理生理基礎(chǔ)為胰島素抵抗和高胰島素血癥，提示胰島素與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。本研究中血胰島素水平與Grb-2、PERK呈正相關(guān)。Grb-2可直接或間接地與生長因子受體或其相連接的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。葉韻斌等[10]研究表明P-ERK的活化需要Grb-2的參與。本研究中子宮內(nèi)膜癌Grb-2與Ras、P-ERK蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，說明Grb-2、Ras、P-ERK的過表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中具有一致性，進(jìn)一步證明胰島素-Ras-MAPK通路在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。理論上MAPK活化后，進(jìn)一步誘導(dǎo)CyclinD1的表達(dá)和活化，但本研究中Grb-2、Ras、PERK均與CD-1蛋白表達(dá)無相關(guān)性，推測CD-1過表達(dá)除受胰島素-Ras-MAPK通路的調(diào)節(jié)外，還受其他因子的調(diào)節(jié)。

本研究揭示了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路在參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展中的重要作用，為子宮內(nèi)膜癌靶向治療提供了理論依據(jù)。但胰島素-Ras-MAPK信號(hào)通路還包括哪些重要的信號(hào)因子、在子宮內(nèi)膜癌中與PI3K-Akt信號(hào)通路的協(xié)同作用均有待于進(jìn)一步的研究。

[1]趙敬,薛鳳霞,華紹芳,等.胰島素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2007,42(10):696-700.

[2]華紹芳,薛鳳霞,趙敬.磷脂酰肌醇3激酶通路在胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2007,23(11):843-845.

[3]Sundaram MV.RTK-Ras-MAPK signaling[M].Worm Book.11th ed.2006.1-19.

[4]Yu GZ,Chen Y,Long YQ,et al.New insight into the key proteins and pathways involved in the metastasis of colorectal carcinoma[J].Oncol Rep,2008,19(5):1191-204.

[5]Yu GZ,Chen Y,Wang JJ.Overexpression of Grb-2-HER2 signaling in Chinese gastric cancer:their relationship with clinicopathological parameters and prognostic significance[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(10):1331-9.

[6]薛鳳霞,焦書竹，王海燕,等.子宮內(nèi)膜癌ras及HER-2/neu癌基因的表達(dá)[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1997,32（2）：110.

[7]Mueller H,Flury N,Eppenberger-Castori S,et al.Potential prognostic value of mitogen-activated protein kinase activity for disease-free survival of primary breast cancer patients[J].Int J Cancer,2000,89(4):384-8.

[8]Choudhury M,Bansal S.Expression of cyclin D1 in endometrial hyperplasia and endometrial carcinoma[J].Indian J Pathol Microbiol,2007,50(4):708-710.

[9]葉韻斌,陳慧菁.抑制生長因子受體連接蛋白22表達(dá)對(duì)乳癌細(xì)胞生長的影響[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2008,22(1):55-62.