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    PCR引物濃度對(duì)寡核苷酸液相雜交的影響

    2010-07-13 08:58:18李義良易進(jìn)華夏佳慧周文艷范麗麗
    關(guān)鍵詞:寡核苷酸微珠探針

    李義良,易進(jìn)華,夏佳慧,周文艷,范麗麗

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    PCR引物濃度對(duì)寡核苷酸液相雜交的影響

    李義良,易進(jìn)華,夏佳慧,周文艷,范麗麗

    201210 上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司

    考察 PCR 引物濃度配比對(duì)液相微珠雜交效率的影響,尋求具有較強(qiáng)雜交信號(hào)和較好穩(wěn)定性的 PCR 引物濃度配比。

    建立 HLA-DRB1 等位基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù),選擇在 HLA-DRB1 位點(diǎn)的第二外顯子上設(shè)計(jì)探針,并且選擇其保守序列作為陽(yáng)性對(duì)照探針(DPC2),DPC2 探針中間位點(diǎn) T 突變成 A 作為陰性對(duì)照探針(DNC)。分別針對(duì)標(biāo)本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設(shè)計(jì)出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針,各探針 5’ 端用氨基(NH2)修飾。通過(guò)引物濃度梯度配比(1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1),對(duì)型別已知的細(xì)胞株 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并得到目的片段(1:100 配比除外),在相同條件下將 PCR 產(chǎn)物與寡核苷酸探針進(jìn)行液相雜交檢測(cè)。

    濃度配比為 1:1 的對(duì)稱(chēng)式擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果不理想,而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增均得到了待檢單鏈、雙鏈 DNA 混合物,其中 1:4 濃度配比具有最好的擴(kuò)增效率和穩(wěn)定性。根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)與陽(yáng)性標(biāo)本是否相符表明:引物濃度配比為 1:100 的不對(duì)稱(chēng) PCR 和 1:1 的對(duì)稱(chēng) PCR 檢測(cè)效果差,易出現(xiàn)假陰性;1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測(cè)效果較好,比較穩(wěn)定。

    PCR 引物濃度配比影響液相微珠雜交效率,不對(duì)稱(chēng) PCR 產(chǎn)物有利于提高雜交效率,為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎(chǔ),有利于寡核苷酸液相芯片的應(yīng)用。

    聚合酶鏈反應(yīng); 寡核苷酸序列分析; 核酸雜交

    液相芯片是 20 世紀(jì) 90 年代中期發(fā)展起來(lái)的,以美國(guó) Luminex 公司的 xMAP(flexible multi- analyte profiling)技術(shù)為基礎(chǔ),既能保證信息質(zhì)量,又能提供相對(duì)高通量的新一代分子檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)[1-2]。xMAP 液相芯片體系由許多不同顏色的微珠為主要基質(zhì)構(gòu)成,每種微珠表面共價(jià)連接有不同的寡核苷酸探針?lè)肿?,將這些微珠懸浮于一個(gè)液相體系中,就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)。雜交在懸浮的液相中進(jìn)行,空間位阻小,所需反應(yīng)時(shí)間短,雜交后不用清洗就可以直接讀數(shù),檢測(cè)效率大大高于固相雜交。xMAP 液相基因芯片已廣泛應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析[3]、組織相容性抗原分型[4]、基因表達(dá)分析等[5]研究,可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。目前寡核苷酸間的分離和雜交過(guò)程已被進(jìn)行了較深入的研究[6-7],但仍有很多問(wèn)題亟待解決。影響寡核苷酸液相芯片雜交效果的因素有很多,樣品制備是其中一重要影響因素。傳統(tǒng)對(duì)稱(chēng) PCR,擴(kuò)增所得產(chǎn)物為雙鏈 DNA,不經(jīng)過(guò)堿變性或熱變性,無(wú)法同寡核苷酸探針雜交。即使通過(guò)變性步驟后,雜交效率也比較低。而且,DNA 雙鏈間的復(fù)性作用力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于核酸與寡核苷酸探針間的雜交作用力,造成雜交信號(hào)較弱或不穩(wěn)定。用單鏈進(jìn)行雜交被認(rèn)為是排除雙鏈干擾、得到理想雜交結(jié)果的較好方式[8-10]。

    不對(duì)稱(chēng) PCR 由 Gyllensten 和 Erlich[11]在 1988 年首次提出,常被用于獲得單鏈 DNA,目前文獻(xiàn)一般認(rèn)為其限制性引物和非限制性引物濃度最佳配比為 1:50 ~ 1:100,擴(kuò)增效率較低、不穩(wěn)定、難以?xún)?yōu)化并且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。研究表明,相對(duì)于傳統(tǒng)對(duì)稱(chēng) PCR,不對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增效率只有 60% ~ 70%,而前者可達(dá)到 90%,甚至更高[12-13]。此外,還需要控制引物和模板數(shù)量,因而,往往不能保證每次不對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增都獲得成功。如兩條引物濃度相差太大,限制性引物濃度太低,其對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增效率也會(huì)大大降低。

    本文比較了 PCR 引物濃度配比對(duì)寡核苷酸液相雜交的影響,尋求具有一定擴(kuò)增效率,能獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)和穩(wěn)定性的引物濃度配比,以便于建立成功率較高的 PCR 試劑配制標(biāo)準(zhǔn)操作程序,促進(jìn)寡核苷酸液相芯片的 SNP 檢測(cè)和臨床應(yīng)用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 標(biāo)準(zhǔn) DNA HLA 基因型別已知 DNA 標(biāo)本:C2-008、C2-024、C2-025 購(gòu)于美國(guó) UCLA(University of California,Los Angeles)免疫遺傳學(xué)中心,濃度 50 ng/μl,純度 OD260/280 1.65 ~ 2.0。標(biāo)本相應(yīng)基因型詳見(jiàn)表 1 中陽(yáng)性標(biāo)本列。

    表 1 寡核苷酸探針序列及對(duì)應(yīng)陽(yáng)性標(biāo)本

    1.1.2 試劑與微珠 Taq DNA 聚合酶為上海博彩公司產(chǎn)品;鏈親素修飾的藻紅蛋白 PJ31S (StreptavidinR-phycoerythrin,SAPE),2.02 mg/ml,購(gòu)于美國(guó) Prozyme 公司;雜交液為上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;羧基修飾的聚苯乙烯熒光微珠 L100-C103、L100-C105、L100-C107、L100-C113、L100-C130、L100-C197 為美國(guó) Luminex 公司產(chǎn)品。

    1.1.3 主要儀器 多功能懸浮點(diǎn)陣儀 Luminex- 100TM購(gòu)自美國(guó) Luminex Corp 公司;9700 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) ABI 公司;EPS 3500 電泳儀和凝膠成像儀均購(gòu)自美國(guó) Pharmacia 公司;5810R 型平板離心機(jī)購(gòu)自德國(guó) Eppendorf 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 雜交微珠制備方法

    1.2.1.1 引物與探針的設(shè)計(jì)、合成與標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[4],并檢索 Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)以及 EMBL(http://www.ebi.ac.uk)數(shù)據(jù)庫(kù)中的 HLA-DRB1 基因序列進(jìn)行整理,建立了 HLA- DRB1 等位基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。HLA-DRB1 基因的第二外顯子的 PCR 引物序列為:上游引物 P1(5’ CCGGATCCTTCGTGTCCCCACACG 3’),下游引物 P2(5’ CCGCTGCACTGTGAAGCTCTC 3’)。下游引物 P2 的 5’ 端進(jìn)行生物素標(biāo)記。

    根據(jù) HLA 等位基因的變異特點(diǎn),選擇在 HLA-DRB1 位點(diǎn)的第二外顯子上設(shè)計(jì)探針,并且選擇第二外顯子上的保守序列作為陽(yáng)性對(duì)照探針(DPC2),DPC2 探針中間位點(diǎn) T 突變成 A 作為陰性對(duì)照探針(DNC)。分別針對(duì)標(biāo)本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設(shè)計(jì)出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針,各探針 5’ 端用氨基(NH2)修飾。上述引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。表 1 為寡核苷酸探針具體序列及對(duì)應(yīng)成陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本。

    1.2.1.2 探針耦聯(lián) ①耦聯(lián)條件:0.1 mol/L的(N-嗎啡基)乙磺酸(MES)(pH 4.5),50 μl;0.1 nmol 氨基修飾寡核苷酸探針;2.5 × 106個(gè)羧基修飾熒光微珠(不同顏色編號(hào)),加入 2.5 μl 40 mg/ml 的 1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二亞胺(EDC)作為催化劑,混合后室溫條件下孵育 30 min(第 15 分鐘時(shí)渦漩混勻一次),然后加入新鮮配制的 EDC 溶液 2.5 μl,室溫條件下孵育 30 min;加入 1 ml 0.02% 吐溫–20,上下顛倒搖勻洗滌,13 000 r/min 離心 2 min,吸除上清;加入 1 ml 0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉),重懸 Beads,上下顛倒混勻洗滌;12 000 r/min 離心 2 min,吸除上清;50 μl Tris-EDTA緩沖液(pH 8.0,NaN3)重懸 Beads,渦漩混勻,4避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    ②質(zhì)檢:選取型別已知,針對(duì)各探針?lè)磻?yīng)結(jié)果均有陰性和陽(yáng)性的不同標(biāo)本作為質(zhì)控標(biāo)本,雜交檢測(cè),探針表現(xiàn)和理論一致,陽(yáng)性、陰性對(duì)應(yīng)出現(xiàn),則表明耦聯(lián)成功,質(zhì)檢合格。

    1.2.1.3 微珠的制備 探針耦聯(lián)質(zhì)檢后混合,使每種編號(hào)微珠數(shù)量為 5 000 個(gè)/μl,組成液相雜交微珠。

    1.2.2 樣品的制備

    1.2.2.1 對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增 ①反應(yīng)體系:模板DNA 2 μl(50 ng/μl),P1、P2 引物量均為 0.4 μmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.2 μl(5 U/μl),10′Buffer 2 μl,加雙蒸水 dd H2O 至終體積 20 μl。②PCR 反應(yīng)條件:96 ℃,3 min;96 ℃,20 s,60 ℃,20 s,72 ℃,20 s,5 個(gè)循環(huán);然后 95 ℃,10 s,60℃,15 s,72 ℃,20 s,35 個(gè)循環(huán);再 72 ℃延伸 10 min。每一樣品分別做 3 個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)。

    1.2.2.2 不對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增 固定下游引物 P2 量為0.4 μmol/L,提高引物 P1:P2 比例至 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50 和 1:100。PCR 反應(yīng)循環(huán)條件同對(duì)稱(chēng) PCR 條件,每一樣品分別做 3 個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)。取其中一批兩種方式 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μl,用含有溴乙錠的 3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后觀察結(jié)果。

    1.2.3 芯片雜交及清洗 雜交體積為 20 μl:每孔加 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,15 μl 雜交混合液[耦聯(lián)好探針的微珠混合液 2 μl,13 μl 1.5′雜交液(4.5 mol/L氯化四甲基銨(TMAC),75 mmol/L Tris,4 mmol/L EDTA,0.15% Sarkosyl 月桂酰-N-甲基氨基乙酸鈉,pH 8.0)]。將雜交板用膜密封好后,低速充分震蕩混勻,PCR 儀 97 ℃變性 7 min,60 ℃孵育 15 min;從 PCR 儀上取下雜交板,每孔立即加 100 μl 的洗滌液(WB),覆膜,離心半徑 18 cm,3 000 r/min 離心 5 min,取出雜交板,迅速甩掉上清液,然后倒置在吸水紙上,去除雜交板面上殘余的液體。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮,每孔加入 120 μl WB,覆膜,離心半徑 18 cm,3 000 r/min 離心 5 min(期間準(zhǔn)備 1′PJ31S 熒光蛋白溶液,把 PJ31S 濃縮液 250 倍稀釋于 1′雜交液中);取出雜交板后,迅速甩掉上清液。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮,每孔加 20 μl 的 1′PJ31S,覆膜,密封后,低速震蕩充分混勻。PCR 儀60 ℃孵育 6 min;從 PCR 儀上取下雜交板,每孔立即加 100 μl 的 WB。離心半徑 18 cm,3 000 r/min 離心 5 min。甩掉洗滌液,每孔加 75 μl 的 WB,吹打混勻后轉(zhuǎn)移到讀板上。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    Luminex 100 儀器讀取標(biāo)本,收集數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)化值(T 值),雜交檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化值 T:T =(MFIProbe-MFIDNA)/(MFIDPC2-MFIDNA)× 100。陽(yáng)性信號(hào)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:熒光強(qiáng)度 > 1000,熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化值明顯大于陰性標(biāo)本對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化值,其比值> 3,否則為陰性。

    2 結(jié)果

    2.1 引物濃度梯度配比 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

    引物濃度梯度配比 PCR 產(chǎn)物電泳,結(jié)果如圖 1 所示。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段的大小為 288 bp,引物濃度配比 1:100(0.004 μmol/L:0.4 μmol/L)、1:50(0.008 μmol/L:0.4 μmol/L)均有較亮的非特異性擴(kuò)增條帶,前者未觀察到目的片段,后者目的條帶也很弱。對(duì)稱(chēng) PCR(1:1 配比,0.4 μmol/L:0.4 μmol/L)產(chǎn)物雙鏈 DNA 片段最亮,但未觀察到單鏈 DNA,其他配比均有效擴(kuò)增出目的片段,為雙鏈 DNA 和單鏈 DNA 混合物,且隨著濃度不對(duì)稱(chēng)配比的縮小,電泳條帶亮度逐漸增加,但0.1 μmol/L:0.4 μmol/L 配比的 PCR 產(chǎn)物單鏈 DNA 條帶最亮,同時(shí)也獲得了較亮的雙鏈 DNA,具有最好的擴(kuò)增效率和穩(wěn)定性。

    2.2 引物濃度配比對(duì)液相微珠雜交結(jié)果的影響

    為避免實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨機(jī)性,PCR 擴(kuò)增時(shí),每個(gè)樣品做 3 次平行考察。在相同條件下將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與寡核苷酸液相微珠進(jìn)行雜交檢測(cè),得到相關(guān)平均值(具體每個(gè)平行孔檢測(cè)數(shù)據(jù)未顯示),如圖 2A、2B 所示。圖 2 中a、b、c 對(duì)應(yīng)標(biāo)本依次為 C2-008、C2-024、C2-025,其中圖 2A 為不同引物濃度配比 PCR 產(chǎn)物雜交后熒光強(qiáng)度均值比較,引物濃度配比為 1:100 的不對(duì)稱(chēng) PCR 和 1:1 的對(duì)稱(chēng) PCR 時(shí),各標(biāo)本對(duì)應(yīng)陽(yáng)性探針熒光值均明顯低于其他配比雜交結(jié)果,小于 1 000(C2-024 標(biāo)本中 PD05 探針除外)。其中 1:20 配比檢測(cè)結(jié)果熒光值最高,1:8、1:4、1:2 配比檢測(cè)結(jié)果熒光值接近。圖 2B 為雜交后熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化值比較,引物濃度配比為 1:1 時(shí),標(biāo)本對(duì)應(yīng)陽(yáng)性探針其標(biāo)準(zhǔn)化值均明顯低于其他配比的雜交結(jié)果,其中在 C2-024 和C2-025 標(biāo)本中,探針 PD13 標(biāo)準(zhǔn)化值與其陰性標(biāo)本 C2-008 中的標(biāo)準(zhǔn)化值很接近,未見(jiàn)有陽(yáng)性熒光信號(hào)(假陰性),探針 PD05 與 PD07 陽(yáng)性也明顯降低。引物濃度配比為 1:100 時(shí),陽(yáng)性探針標(biāo)準(zhǔn)化值最大,但由于內(nèi)對(duì)照陽(yáng)性探針 DPC2 熒光值很低,故整體結(jié)果不理想。其他配比探針陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)化值接近,比較穩(wěn)定。

    圖 1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳比較

    Figure 1 Comparison of amplification products by agarose gel electrophoresis

    在同一條件下雜交檢測(cè)不同引物濃度配比所得擴(kuò)增產(chǎn)物,各柱狀圖顏色表示不同引物濃度配比。標(biāo)本分別為 a:C2-008;b:C2-024;c:C2-025。探針為陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)用“+”號(hào)表示。

    Figure 2 Oligo liquid-bead hybridization results obtained from different primer concentration ratios. [A: Indicate comparison of signal intensity (average products from three individual amplifications); B: Indicate comparison of standardized value of signal intensity]

    根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)是否與陽(yáng)性標(biāo)本相符表明:引物濃度配比為 1:100 的不對(duì)稱(chēng) PCR 和 1:1 的對(duì)稱(chēng) PCR 檢測(cè)效果差,易出現(xiàn)假陰性;1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測(cè)效果較好,比較穩(wěn)定。

    3 討論

    DNA 液相雜交較復(fù)雜,尤其當(dāng) PCR 擴(kuò)增效率低或所得產(chǎn)物為雙鏈 DNA 時(shí),導(dǎo)致許多拷貝數(shù)低的基因無(wú)法有效檢測(cè),許多探針出現(xiàn)假陰性,檢測(cè)靈敏性和穩(wěn)定性差。我們?cè)谠噭┭邪l(fā)、配制生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn):同一序列引物,合成后按對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增質(zhì)檢,檢測(cè)效果好,陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng),但再次合成后按同一引物濃度配比進(jìn)行對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增檢測(cè),電泳觀察,目的片段大小正確,條帶很亮,但雜交檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)很弱,按對(duì)稱(chēng) PCR 方式調(diào)整引物濃度,檢測(cè)結(jié)果也無(wú)改觀。按不對(duì)稱(chēng) PCR 方式調(diào)整引物濃度配比后,電泳條帶相對(duì)較弱,甚至很弱時(shí)也獲得了較好的檢測(cè)結(jié)果。因此,建立具有一定擴(kuò)增效率,同時(shí)又能產(chǎn)生大量單鏈的 PCR 方法、提高液相芯片的重復(fù)性、可靠性和敏感性非常重要。

    DNA 雙鏈中只有一條鏈可與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng),另一條鏈則作為干擾鏈存在。本研究結(jié)果與此一致:引物濃度配比為 1:1 的對(duì)稱(chēng) PCR 產(chǎn)物,電泳條帶雖很亮,但雜交后陽(yáng)性探針(DPC2)熒光值很弱,較其他不對(duì)稱(chēng) PCR(濃度配比為 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50)的熒光值偏低很多。在 C2-024、C2-025 標(biāo)本中,探針 PD13 未見(jiàn)有陽(yáng)性熒光信號(hào),出現(xiàn)假陰性;對(duì)應(yīng) C2-025 標(biāo)本,PD07 探針熒光值信號(hào)與陰性標(biāo)本(C2-024)熒光值信號(hào)接近,也未見(jiàn)有明顯陽(yáng)性熒光信號(hào)(假陰性);C2-024 標(biāo)本中,PD05 探針熒光值信號(hào)也明顯低于其他配比檢測(cè)到的熒光值信號(hào)。Wei 等[8]也觀察到:當(dāng)引物濃度高于 0.63 μmol/L 時(shí),隨著雙鏈 DNA 量的增加,雜交檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度反而降低。對(duì)此現(xiàn)象很難找出具體原因,高濃度的雙鏈靶分子可能存在較高的自我退火比率,增加了雜交的競(jìng)爭(zhēng)壓力,從而降低雜交效率。另外,微珠表面一定范圍內(nèi)靶分子太多,可能造成空間擁擠,反而降低雜交效率,不易與探針雜交。我們?cè)谑覝叵录尤脒m量強(qiáng)堿反應(yīng)15 min,使雙鏈變性,用適量醋酸中和再進(jìn)行后續(xù)雜交檢測(cè),但結(jié)果與熱變性結(jié)果一致:雜交對(duì)稱(chēng) PCR 產(chǎn)物,探針仍有假陰性出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示),可能在雜交過(guò)程中互補(bǔ)鏈仍會(huì)與探針競(jìng)爭(zhēng)與靶鏈 DNA 的雜交,使反應(yīng)體系中實(shí)際用于雜交的靶序列濃度降低,從而影響雜交效率。

    不對(duì)稱(chēng) PCR 產(chǎn)物雜交檢測(cè)結(jié)果,均沒(méi)有假陰性情況出現(xiàn),而且陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)、較穩(wěn)定,用單鏈進(jìn)行雜交可排除雙鏈干擾、得到理想雜交結(jié)果[8-10]。引物濃度配比為 1:100 時(shí),標(biāo)本對(duì)應(yīng)陽(yáng)性探針均很強(qiáng),但由于內(nèi)對(duì)照陽(yáng)性探針 DPC2 熒光值很低,故整體結(jié)果不理想,不能采用。

    綜上所述:對(duì)稱(chēng)式擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果不理想,而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對(duì)稱(chēng)式擴(kuò)增顯著地提高雜交效率,有利于寡核苷酸液相雜交微珠的應(yīng)用。采用 1:4(0.1 μmol/L:0.4 μmol/L)引物配比進(jìn)行不對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增,可保證一定的擴(kuò)增效率和單鏈 DNA 的生成,配制 PCR 引物反應(yīng)液時(shí),可以此引物濃度配比為基準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)試調(diào)整,為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎(chǔ)。

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    Effects of the primer concentration on the liquid-phase oligonucleotide hybridization

    LI Yi-liang, YI Jin-hua, XIA Jia-hui, ZHOU Wen-yan, FAN Li-li

    Author Affiliation: Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., 201210, China

    This study investigated the impact of ratios of PCR primer concentration on the liquid-Bead hybridization efficiency to find appropriate ratio of primer concentration with a stronger hybridization signal and the hybrid stability.

    Database of HLA-DRB1 alleles was established. Probes were designed according to the sequence of exon 2 of HLA-DRB1 locus. Conserved sequence were selected for positive control probe design (DPC2). Negative control probe was synthesized through a mutation from T to A in the middle of the sequence of DPC2. Six oligo probes about 21 bp were designed specially targeted to allele sequences from samples C2-008, C2-024 and C2-025 separately. The 5'-terminal sequences of each probe were modified by NH2. Genomic DNA from cell lines with known types was amplified with different ratios of primer concentration (1:100, 1:50, 1:20, 1:8, 1:4, 1:2, 1:1). Target fragments were obtained except from amplification with 1:100 ratio. PCR products were hybridized with oligonucleotide probes by liquid hybridization under same conditions.

    Hybridization results from symmetric PCR products by concentration ratio of 1:1 are not satisfactory, while mixture of single-strand DNA and double-stranded DNA under test was obtained from asymmetric amplifications by ratios of 1:20, 1:8, 1:4, and 1:2, in which the best amplification efficiency and stability from the concentration ratio of 1:4. From the consistency of positive samples and positive signals, false negative results were common due to ratios of primer concentration 1:100 and 1:1.

    The concentration ratio of PCR primers affects the efficiency of liquid-phase bead hybridization. Asymmetric PCR products help improve the hybridization efficiency. Our results established the foundation to prepare PCR reagents quickly and successfully in favour of liquid-phase oligonucleotide chip applications. Better results and stability would be expected using other ratios.

    Polymerase chain reaction; Oligonucleotide array sequence analysis; Nucleic acid hybridization

    LI Yi-liang, Email: yiliangli@yahoo.com.cn

    李義良,Email:yiliangli@yahoo.com.cn

    2009-11-23

    10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.008

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