MAP30 全長基因的克隆及在巴斯德畢赤酵母中的高效表達(dá)研究

朱振洪，楊威威，葛立軍，萬海同

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MAP30 全長基因的克隆及在巴斯德畢赤酵母中的高效表達(dá)研究

朱振洪，楊威威，葛立軍，萬海同

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院生物與制藥工程教研室

研究畢赤酵母中高效表達(dá)全長 MAP30 蛋白及其生物活性。

根據(jù) GeneBank 公布的 MAP30 全序列設(shè)計特異性引物，以苦瓜基因組為模板，PCR 擴增 MAP30 全長基因，將該基因插入 pPIC9k 載體中，經(jīng)I酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至 GS115 細(xì)胞，再通過 G418 篩選，最終獲得了高拷貝重組 GS115 菌株。重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下，SDS-PAGE 分析表達(dá)的特異性條帶，運用Pharmacia VDS 圖像分析軟件進(jìn)行條帶密度掃描，得到各條帶的掃描曲線圖，計算出同一泳道目的蛋白條帶峰面積相對于整個曲線所占的百分比，即蛋白純度，并根據(jù)蛋白純度和上清蛋白總量（Lowry 法）計算出發(fā)酵上清液中目標(biāo)蛋白含量。純化時首先用 75% 的飽和硫酸銨鹽析，然后用 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水層析，再用 CM-sepharose FF 陽離子層析。采用 MTT 法檢測MAP30 蛋白對人胃癌細(xì)胞株 SGC7901 的抑制作用。為驗證重組 MAP30 蛋白結(jié)構(gòu)的正確性，采用 Edman 降解法分析末端 8 個氨基酸。

重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下，SDS-PAGE 分析可見相對分子質(zhì)量 32 000 的特異性條帶，重組蛋白占上清液總蛋白的 67%；發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、疏水和陽離子交換層析后，目的蛋白總回收率為 32.4%。MTT 法檢測結(jié)果表明，重組 MAP30 蛋白具有明顯的抑制人胃癌細(xì)胞 SGC7901 的活性，IC50為 30mg/ml。端的 8 個氨基酸測序進(jìn)一步證實與理論一致。

重組 MAP30 蛋白在畢赤酵母中正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有抑制腫瘤細(xì)胞的活性。

苦瓜； 核糖體蛋白質(zhì)類； 畢赤酵母； 基因表達(dá)

MAP30（momordica anti-HIV protein of 30 kD）是 1990 年 Lee-Huang 等[1]首次從苦瓜（）果實和種子中分離得到的單鏈核糖體失活蛋白。MAP30 基因沒有內(nèi)含子，全長 861 bp，編碼 286 個氨基酸，理論相對分子質(zhì)量為 32 000，如果切除端 23 個氨基酸的引導(dǎo)肽，則 MAP30 蛋白為 263 個氨基酸，相對分子質(zhì)量變?yōu)?30 000。其 51 ~ 53 位的 Asn-Leu-Thr 是連接糖基化位點。MAP30 的二級結(jié)構(gòu)含有 8 個 α 螺旋和9 個 β 折疊，其端和端分別富含 β 折疊和 α 螺旋[2]。MAP30 具有抗病毒、抗腫瘤和抗微生物等多種生物學(xué)活性[3]，尤其對 HIV 有顯著的抑制作用，重組蛋白也具有與天然蛋白相同的功能和活性，MAP30 可以特異地抑制受病毒感染的細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)凋亡，但對正常細(xì)胞沒有毒副作用[4-5]，因此具有巨大的臨床應(yīng)用價值。

由于從植物中直接提取 MAP30 蛋白成本高、工藝復(fù)雜，所以采用基因工程手段生產(chǎn)重組 MAP30 蛋白是有效途徑。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)盡管操作方便，但表達(dá)產(chǎn)物易形成無活性的包涵體，不利于分離純化[6-7]。巴斯德畢赤酵母（）利用甲醇作為唯一碳源，既具有原核表達(dá)系統(tǒng)良好的可操作性，又有真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點，如蛋白質(zhì)的加工、翻譯后修飾等，該系統(tǒng)可進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)，表達(dá)量高，是外源基因理想的表達(dá)系統(tǒng)。本研究通過設(shè)計特異性引物，克隆 MAP30 全長基因，通過在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)蛋白，測定抑制腫瘤細(xì)胞的活性，為該重組蛋白進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

廣東長身品種新鮮苦瓜選購于杭州市慶春路世紀(jì)聯(lián)華店；質(zhì)粒 pPIC9、pPIC9K，大腸桿菌 Top 10，酵母 GS115 細(xì)胞均為浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物與制藥工程實驗室保存；人胃癌細(xì)胞系 SGC7901 由浙江大學(xué)生物化學(xué)研究所生物制藥實驗室贈送；限制性內(nèi)切酶I、R I、H I、I 及酶、高保真酶、T4 DNA 連接酶等均為加拿大 MBI Fermentas 公司產(chǎn)品；G418 購自美國 GIBCO 公司；蛋白胨及酵母抽提物為英國 Oxid 公司產(chǎn)品；YNB 購自美國 Difco 公司；D-生物素、D-山梨醇購自德國 Sigma 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒等購自北京博大泰克公司；RPMI-1640、胎牛血清購自美國 GIBCO 公司、胰蛋白酶等購自德國 Sigma 公司；其余為國產(chǎn)分析純。凝膠成像系統(tǒng)為 Pharmacia VDS 系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)為美國 Bio-rad 公司產(chǎn)品；Phenyl Sepharose 6 FF 和 CM-Sepharose FF 樹脂購自美國Pharmacia 公司

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù) GeneBank 中 MAP30 蛋白全長序列，設(shè)計了 1 對特異性引物。上游引物：5’CCGAAAAGAATGGTGAAATGCTTAC TACTT 3’，引入I限制性酶切位點（劃線部分）。下游引物：5’ CGTCAATTCACAAC AGATTCCC 3’，引入RI限制性酶切位點（劃線部分）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 MAP30 基因的擴增 采用改良 SDS 法[8]從新鮮苦瓜表皮中提取基因組總 DNA，以總 DNA 作為模板，加入與混合酶（4:1），PCR 擴增MAP30 基因。PCR 反應(yīng)體系為：10 倍緩沖液（不含 Mg2+）5ml，MgCl2（25 mmol/L）3ml，dNTP（2 mmol/L）3ml ，引物（3 mmol/L）各 2ml，DNA 聚合酶（5 U/ml）1ml，模板 DNA 5 ng，用無菌雙蒸水補足至體積至 50ml。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min ；（94 ℃ 1 min，51 ℃ 45 s，72 ℃1 min）共 30 個循環(huán)，72 ℃保溫 7 min。用 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 結(jié)果，并使用 DNA 膠回收試劑盒分離純化 PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 MAP30 基因的測序 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過RI +I內(nèi)切酶消化后直接連接到 pPIC9 載體（RI+I雙酶切）片段上，CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10，隨機挑選若干菌落培養(yǎng)，雙酶切初步鑒定后，送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，測序所用引物為 pPIC9 通用引物[5’ AOX1Primer（855-875），3’ AOX1 Primer（1327-1347）]。測序結(jié)果通過 NCBI 網(wǎng)站上的Blast 軟件比對。

1.2.4 pPIC9K-MAP30 重組載體的構(gòu)建 將 MAP30 和a-因子基因一起酶切下來，連接至pPIC9K 載體上（HI +RI雙酶切），連接產(chǎn)物經(jīng) CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top 10，在含氨芐青霉素（100mg/ml）LB 平板上初步篩選。然后通過質(zhì)粒小量抽提、酶切鑒定等獲得到有外源基因插入的陽性克隆。

1.2.5 酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定 按 Invitrogen 公司操作手冊，首先將重組載體經(jīng)I 酶切線性化后，再采用電轉(zhuǎn)化方法（1500 V，25mF，200W，4 mS）轉(zhuǎn)入 GS115 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂 MD 平板，30 ℃培養(yǎng) 3 ~ 5 d，觀察菌落生長情況。將 MD 平板上長出的 His+轉(zhuǎn)化子，用涂布棒刮下后用無菌水稀釋至吸光度（600）值為 0.01，然后涂細(xì)胞至含不同 G418 濃度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/ml）的 YPD 平板上，30 ℃中再培養(yǎng) 3 ~ 5 d，觀察各平板菌落生長情況。挑選抗性平板上生長良好的菌落，然后采用菌落 PCR 方法，用原引物進(jìn)行 PCR 擴增，鑒定出含有外源基因插入的重組酵母菌株，命名為 GS115/pPIC9K-MAP30，并通過 MM 平板確定其表型（Mut+or Muts）。

1.2.6 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

⑴表達(dá)方法：挑取若干重組酵母單菌落于 YPD 培養(yǎng)基中活化后，接種于緩沖的甘油復(fù)合培養(yǎng)基（BMGY）中，30 ℃振蕩培養(yǎng) 16 ~ 20 h 至600為 2 ~ 6，離心2 500′，5 min 收集菌體，換用 BMMY 培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，每隔 24 h 補加甲醇至終濃度為 1.0%，連續(xù)表達(dá)4 d，分別于 24、48、72、96 h 離心收集上清液，SDS-PAGE 分析蛋白，篩選表達(dá)量最高的菌株。

⑵目的蛋白純度的測定：取 50ml重組酵母的發(fā)酵上清液，高速離心8 000′，5 min，去雜質(zhì)，再加等體積的 2 倍蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸后，取 20ml 進(jìn)行 sds-page，考馬斯亮藍(lán) R-250 染色，運用Pharmacia VDS 圖像分析軟件掃描條帶密度，得到各條帶的掃描曲線圖，計算出同一泳道目的蛋白條帶的峰面積相對于整個曲線所占的百分比，即蛋白純度（%）。

⑶上清液中目的蛋白含量的測定：首先采用Lowry 法[9]定量測定發(fā)酵上清液中總蛋白濃度?？偟鞍缀浚╩g）′目的蛋白純度（%）= 發(fā)酵上清液中目標(biāo)蛋白含量。

1.2.7 重組 MAP30 蛋白的分離純化

⑴初步純化：離心8 000′，10 min，收集發(fā)酵上清液，首先采用不同飽和濃度（20%、40%、50%、75%）的硫酸銨鹽析，通過 SDS-PAGE 電泳檢測沉淀后目的蛋白純度，獲得硫酸銨最佳飽和濃度。鹽析后的沉淀用 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）復(fù)溶后，直接用 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水層析樹脂分離純化，上樣緩沖液為：10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）+ 1 mol/L (NH4)2SO4，洗脫緩沖液為：10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。

⑵精細(xì)純化：將疏水層析洗脫蛋白調(diào) pH 至 7.4，再用 CM-sepharose FF 陽離子層析柱分離純化，上樣緩沖液為：10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），洗脫緩沖液為：10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）+ 1 mol/L NaCl。收集洗脫峰透析除鹽。

1.2.8 重組 MAP30 蛋白的鑒定及抑制腫瘤活性的測定 首先將純化后的樣品轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，送上?；瞪锛夹g(shù)公司進(jìn)行端測序。采用 MTT 法[10]檢測重組蛋白對人胃癌細(xì)胞株 SGC7901 的抑制作用。由于該重組蛋白是溶解在10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，所以樣品稀釋液和空白對照組均采用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。首先在 96 孔培養(yǎng)板中接種 2′104細(xì)胞/孔，每孔 100ml，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后吸出培養(yǎng)液，加入含不同稀釋度的樣品，同時設(shè)立空白對照組，每濃度設(shè) 5 個復(fù)孔。培養(yǎng) 48 h 后，每孔加入 20ml MTT（5 mg/ml），震蕩混勻后，繼續(xù)孵育 4 h，小心棄去上清液，加入 150ml DMSO，振蕩 10 min，在酶標(biāo)儀上波長 490 nm 處測其值，計算細(xì)胞抑制率。其公式為：細(xì)胞抑制率（%）=（1-實驗組值/對照組值）× 100%。劑量和效應(yīng)關(guān)系用Origin 6.1 軟件進(jìn)行回歸分析并求出半抑制率（IC50）。

2 結(jié)果

2.1 MAP30基因的擴增和測序

根據(jù)特異性引物，運用 PCR 擴增獲得 860 bp 左右的目的條帶，與預(yù)期的相對分子質(zhì)量一致（圖 1）。該基因經(jīng)I 與RI 雙酶切，被克隆至 pPIC9 載體，所獲得的基因序列通過比對發(fā)現(xiàn)，與GeneBank（AF284811）的核苷酸同源性達(dá) 99.88%，翻譯后氨基酸的同源性達(dá) 100%。整個基因編碼區(qū)為 861 bp。

M：標(biāo)記物（lDNA/EcoR I + Hind III）；1：PCR 產(chǎn)物

Figure 1 Amplification of MAP30 gene by PCR

2.2 pPIC9K-MAP30 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

從含氨芐青霉素的平板上挑選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒抽提，H I 和R I 雙酶切鑒定，切出約 1100 bp大小的片段（圖 2），與 MAP30 及a-因子融合基因理論值之和大小一致，證實外源基因已克隆到畢赤酵母 pPIC9K 載體上。

M：標(biāo)記物（lDNA/EcoR I + Hind III）；1 ~ 2：重組 pPIC9K-MAP30 質(zhì)粒；3：pPIC9K-MAP30 質(zhì)粒經(jīng)Sac I單酶切；4：pPIC9K-MAP30 質(zhì)粒經(jīng)BamHI + EcoR I酶切

Figure 2 Identification of recombinant plasmid pPIC9K- MAP30 by restriction digestion

2.3 電轉(zhuǎn)化及重組酵母菌的篩選與鑒定

重組表達(dá)載體 pPIC9K-MAP30 經(jīng)I 酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化畢巴斯德赤酵母菌 GS115，在 MD 培養(yǎng)基平板上長出700 個左右 His+轉(zhuǎn)化子，上述轉(zhuǎn)化子通過含 G418 不同濃度的 YPD 平板上篩選，最后在含 2.5 mg/ml G418 的 YPD 培養(yǎng)基上獲得 6 個高抗性菌株。菌落 PCR 顯示該菌株都有外源目的基因的插入（圖 3）。

M：標(biāo)記物（(lDNA/EcoR I + Hind III)；1：PCR 產(chǎn)物的陽性對照；2 ~ 7：6 個不同的單菌落的 PCR 產(chǎn)物

Figure 3 Identification of positive clones by PCR

2.4 重組 GS115 酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)過 MM 和 MD 平板鑒定，所獲得的菌株為 His+/MutS型。按 MutS型菌株的表達(dá)操作方法，將重組菌株通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，取不同時間點的上清液進(jìn)行 SDS-PAGE 分析（圖4）。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后上清液中在相對分子質(zhì)量 32 000處有目的條帶出現(xiàn)，與理論分子量相符。表達(dá)量占酵母總分泌蛋白量的67%，結(jié)合 Lowry 法測得上清液總蛋白，計算出目標(biāo)蛋白表達(dá)水平為 910 mg/L。進(jìn)一步研究顯示，在甲醇誘導(dǎo) 24 h 后就能檢測到表達(dá)產(chǎn)物，隨著時間的延長，表達(dá)量不斷提高，至 96 h 表達(dá)量達(dá)到最高。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

通過不同硫酸銨飽和濃度的分級沉淀，發(fā)現(xiàn)75% 飽和濃度鹽析效果最佳，既可以去掉一些雜蛋白，又可以對產(chǎn)物進(jìn)行濃縮。然后經(jīng)過疏水和陽離子交換兩步層析，重組蛋白總回收率為 32.4%，重組蛋白純度達(dá) 96%，純化數(shù)據(jù)如表 1 所示。

M：標(biāo)記物；1：誘導(dǎo)前；2 ~ 4：甲醇誘導(dǎo)后 24、48、72、96 h

Figure 4 SDS-PAGE analysis of expressing suspension

2.6 N端氨基酸測序及產(chǎn)物活性初步鑒定

端氨基酸測序結(jié)果表明，重組全長 MAP30 蛋白端8個氨基酸為 VKCLLLSF，與理論值完全相符，證實該重組蛋白在巴斯德畢赤酵母中獲得正確表達(dá)。

將不同濃度重組 MAP30 加入 96 孔細(xì)胞，48 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，倒置顯微鏡下顯示未處理的SGC7901 細(xì)胞生長良好，而實驗組隨藥物濃度的增加，細(xì)胞萎縮明顯，離壁變圓，細(xì)胞胞質(zhì)突起，核仁減少，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝聚，并可見單獨存在的凋亡細(xì)胞（圖 5）。通過 MTT 檢測細(xì)胞生長抑制活性，發(fā)現(xiàn)不同濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/ml）對胃癌細(xì)胞 SGC7901 的抑制率分別為：8.64%、11.7%、32.5%、89.1%、92.2%、93.27%、93.5%。隨著 MAP30 濃度的升高，對 SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制效果愈加明顯（圖 6），上述數(shù)據(jù)經(jīng) Origin 6.1 軟件計算 IC50為30mg/ml。

表 1 重組 MAP30 蛋白純化效果

注：“—”：無

Note: “—”indicate non

圖 5 重組 MAP30 作用于胃癌細(xì)胞 SGC7901 的相差顯微照片× 200（A：正常的胃癌SGC7901 細(xì)胞；B：胃癌 SGC7901 細(xì)胞經(jīng) 50 mg/ml 的重組 MAP30 蛋白作用 48 h；C：胃癌 SGC7901 細(xì)胞經(jīng) 100 mg/ml 的重組 MAP30 蛋白作用 48 h）

Figure 5 Phase-contrast microscope photos of SGC7901 cells treated by recombinant MAP30 × 200. A: Normal control of SGC7901; B: SGC7901 treated with recombinant MAP30 at the concentration of 50mg/ml; C: SGC7901 treated with recombinant MAP30 at the concentration of 100mg/ml.

圖 6 重組 MAP30 對胃癌細(xì)胞 SGC7901 的抑制活性

Figure 6 Inhibitory activities of recombinant MAP30 in SGC7901 cells

3 討論

本研究結(jié)果表明，重組 MAP30 蛋白對人胃癌細(xì)胞 SGC7901 具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性，IC50為 30mg/ml。而李春陽等[11]提取的天然 MAP30 對胃癌細(xì)胞 SGC7901 的 IC50為18mg/ml，說明重組 MAP30 比天然提取的蛋白活性稍低。而與林育泉等[12]運用大腸桿菌表達(dá)的重組 MAP30 相比，畢赤酵母表達(dá)的重組 MAP30 活性明顯高。Arazi等[13]利用植物表達(dá)載體將 MAP30 基因轉(zhuǎn)入到其他葫蘆科植物中，在這些植物的果實中成功表達(dá)了 MAP30 蛋白。巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)屬真核高效表達(dá)系統(tǒng)，利用其表達(dá)重組 MAP30 蛋白具有產(chǎn)量高、純化工藝簡單、產(chǎn)物活性好和成本低的優(yōu)勢。本研究構(gòu)建的重組菌株在搖瓶中的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為 910 mg/L，經(jīng)過 3 步純化后蛋白純度為 96%，總回收率達(dá) 32.4%，下一步該菌種將在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行一系列發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，使目的蛋白表達(dá)量進(jìn)一步提高，為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

從傳統(tǒng)中藥和植物資源中尋找新的藥物是今后一個重要的發(fā)展方向，而植物蛋白具有多方面的生物活性，如天花粉蛋白（TCS）是從葫蘆科植物栝樓的塊根中提取蛋白，具有較好的抗腫瘤活性。另外從絲瓜種子中獲得的絲瓜毒素，從大戟科的多花白樹種子中獲得的 GAP31 蛋白等，都具有抗病毒、抗腫瘤等活性。重組 MAP30 成功表達(dá)為該藥物的進(jìn)一步研究提供了良好的基礎(chǔ)，例如將重組 MAP30 蛋白與單克隆抗體、激素、生長因子等進(jìn)行交聯(lián)，制成免疫毒素在腫瘤、艾滋病治療及骨髓移植等方面有著令人鼓舞的前景。另外 MAP30 蛋白抗腫瘤機制除了使腫瘤細(xì)胞核糖體失活而抑制蛋白合成外，還可使超螺旋 DNA 松弛斷裂而拓?fù)涫Щ睿绊?DNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄以及抑制癌基因的過度表達(dá)。但是研究發(fā)現(xiàn) MAP30 對腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，說明 MAP30 對這 2 種細(xì)胞之間存在不同的細(xì)胞信號途徑，因此對于 MAP30 作用于腫瘤細(xì)胞的信號途徑需要進(jìn)一步研究，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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Research on cloning and expression of overall length MAP30 gene in pichia pastoris and bioactivity assay

ZHU Zhen-hong, YANG Wei-wei, GE Li-jun, WAN Hai-tong

Author Affiliation: College of bioengineering, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

In order toefficiently express overall length MAP30 gene and study the bio-activity of recombinant MAP30.

The specific primers were designed according to MAP30 gene sequence in GeneBank. Then full length sequence of MAP30 gene was amplified by PCR with the genome DNA template of Momordica charantia. After sequencing analysis, it was cloned into pPIC9K vector. The vector linearized byI was transformed into pichia pastoris GS115 by electroporation. Multi-copy inserts was screened by resistance against G418.The multicopy recombinant was induced expression with methanol. Total protein quantity was measured by Lowry method, and purity of target protein was tested by scan of the SDS-PAGE, then the content of recombinant protein in pichia culture medium could be calculated by multiplying total protein (mg) and target protein purity (%). Three purification steps were adopted. Firstly, the supernatant was salted out by 75% (NH4)2SO4, then hydrophobic chromatography was used by Phenyl Sepharose FF, finally Ion-exchange chromatography was adopted through CM-Sepharose FF. The bio-activity assay was carried out with gastric carcinoma cell line SGC7901 by MTT method. Protein-terminal sequence was also analyzed by Edman degradations method.

SDS-PAGE showed that MAP30 was successfully expressed, the molecular weight is 32 kD. Content of recombinant protein was as much as 67% total protein in pichia culture medium. After three steps purification, overall recovery is about 32.4%. Anti-tumor assay showed that it can inhibit SGC7901 cell line. The dose required for 50% inhibition (IC50) were 30mg/ml. Sequence of eight amino acid at-terminal was in complete accord with theoretic sequence.

Recombinant MAP30 was successfully expressed in pichia pastoris, and it has inhibition of tumor cells.

Momordica charantia; Ribosomal proteins; Pichia; Gene expression

ZHU Zhen-hong, Email: zhenhongzhu@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.006

浙江省教育廳資助項目（Y200805653）

朱振洪，Email：zhenhongzhu@yahoo.com.cn

2009-11-23