bFGF對腦缺血再灌注大鼠ICAM-1表達及腦組織含水量的影響

聞公靈 婁季宇 白宏英

1)河南南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473009 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷時的炎癥反應(yīng)促進了腦梗死的繼發(fā)性腦損害。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM-1)是最重要的白細胞-內(nèi)皮細胞間黏附分子之一,其在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點。本實驗將通過觀察bFGF對缺血再灌注腦組織中性粒細胞浸潤和對ICAM-1表達的檢測,探討bFGF對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及給藥選擇體質(zhì)量為270～320 g的健康SD大鼠48只,雌雄各半(由河南省實驗動物中心提供),隨機分成假手術(shù)組、缺血再灌注組、bFGF組,每組16只。bFGF為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制,用注射用水稀釋,bFGF組腹腔注射10μ g/kg,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.2動物模型制作用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛300 mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術(shù)組除不插線外,余同上。

1.3大鼠腦含水量的測定造模后,快速斷頭,開顱取腦,取右側(cè)前腦1/4部分稱重(濕腦重),然后在 110°C烤箱中烤至恒重,分析天平稱重(干腦重),計算腦含水量%=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。

1.4腦缺血后腦毛細血管通透性測定每組取8只大鼠,假手術(shù)組于尾靜注伊文思藍50 mg/kg,不阻斷大腦中動脈,其余兩組則在阻斷大腦中動脈前5 min由尾靜注伊文思藍50 mg/kg。缺血1 h再灌注24 h后,斷頭取腦,稱重,將腦浸泡于5 mL甲酰胺中,在45°C恒溫箱中溫育72 h。取溫育液,用722型分光光度計在620 nm處測定吸收度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出腦內(nèi)伊文思藍的含量(ug/g濕腦重)。

1.5腦缺血大鼠腦組織形態(tài)觀察每組取8只大鼠,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。HE染色,光鏡檢查。觀察白細胞浸潤。

1.6免疫組織化學(xué)染色檢測ICAM-1 采用SABC法,石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復(fù) 20 min,血清封閉,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗體(購自博士德生物公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC復(fù)合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,雙蒸水終止反應(yīng),脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區(qū)計數(shù)5個視野,計數(shù)陽性微血管數(shù)(血管內(nèi)皮細胞胞漿、胞膜被染成棕黃色顆粒狀),取其均值,以陽性微血管數(shù)/高倍視野表示。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件進行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05作為檢驗水準(zhǔn),P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其的影響實驗結(jié)果表明,大鼠缺血1 h再灌注 24 h后,腦組織出現(xiàn)明顯水腫,表現(xiàn)為腦缺血再灌注組腦含水量與假手術(shù)組比較有明顯增加,有顯著性差異;而bFGF組腦含水量較缺血再灌注組明顯減少,有顯著性差異。表明bFGF能夠?qū)挂蚰X缺血再灌注造成的腦組織水腫現(xiàn)象。結(jié)果見表1。

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其影響 (s)

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n 含水量(%)假手術(shù)組 8 75.38±10.71缺血再灌注組 8 84.92±13.58 bFGF組 8 77.81±9.43△

2.2缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其的影響結(jié)果表明,與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組大鼠腦血管通透性增加,表現(xiàn)為單位腦組織伊文思藍含量顯著升高bFGF組腦組織中伊文思藍含量明顯減少,使單位腦組織伊文斯藍含量恢復(fù)至正?；蚪咏Ｋ?與缺血再灌注組比較有顯著性差異。結(jié)果見表2。

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其影響 (s)

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其影響 (s)

△與缺血再灌注組比較,P＜0.05

組 別 n 伊文斯藍含量(ug·g-1)假手術(shù)組 8 4.01±0.83缺血再灌注組 8 7.51±1.69 bFGF組 8 5.25±2.63△

2.3缺血再灌注腦組織形態(tài)學(xué)變化及bFGF對其的影響鏡下所見,假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;毛細血管腔較窄,神經(jīng)細胞、毛細血管周圍都產(chǎn)生空隙。缺血再灌注組腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶,光鏡下可見大量神經(jīng)元變性壞死,間質(zhì)水腫明顯,神經(jīng)細胞及毛細血管周圍空隙增寬。bFGF組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對正常,間質(zhì)水腫輕,神經(jīng)細胞周圍無明顯的空隙,毛細血管周圍的空隙明顯減小。

2.4缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管的變化及bFGF對其的影響假手術(shù)組未觀察到ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多ICAM-1陽性微血管,在腦組織切片中ICAM-1免疫陽性染色可見于微血管的內(nèi)皮細胞上,明顯的免疫陽性染色出現(xiàn)在缺血再灌注側(cè)半球,并主要局限于缺血區(qū)。bFGF組ICAM-1陽性微血管數(shù)較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05),見表 3。

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管變化及bFGF對其影響 (s)

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管變化及bFGF對其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n ICAM-1假手術(shù)組 8 ——缺血再灌注組 8 24.41±5.33 bFGF組 8 19.53±5.07△

3 討論

腦缺血再灌注時,缺血灶內(nèi)聚集較多細胞因子及黏附分子,造成白細胞大量聚集,阻塞微血管,并釋放大量的炎性介質(zhì),腦組織水腫明顯。腦組織含水量能反映腦水腫的程度。檢測腦組織中伊文氏藍含量的高低可反映血腦屏障通透性變化的程度[2]。本實驗采用bFGF干預(yù)大鼠缺血1 h再灌注24 h,測量各組腦組織含水量、毛細血管通透性變化情況,結(jié)果顯示缺血再灌注組的腦組織含水量、腦血管通透性明顯增加。

腦缺血再灌注后腦水腫加重的原因是多方面的,其中白細胞與血管內(nèi)皮細胞的牢固黏附及其后所產(chǎn)生一系列的病理反應(yīng)[3],是腦缺血再灌注后血腦屏障破壞和腦水腫發(fā)生的重要原因之一。ICAM-1在白細胞與血管內(nèi)皮細胞的牢固黏附過程中起重要作用。本實驗觀察到,在損傷區(qū)皮質(zhì),假手術(shù)組未見ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多的ICAM-1陽性微血管,在病灶區(qū)及半暗帶區(qū)均可見到。應(yīng)用HE染色觀察缺血區(qū)腦組織病理變化情況,結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,毛細血管腔較窄,神經(jīng)細胞、毛細血管周圍都產(chǎn)生空隙。大鼠MCAO 1 h再灌注24 h后,腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶,光鏡下可見大量神經(jīng)元變性壞死,呈現(xiàn)胞體皺縮、變形、核固縮,胞漿濃縮呈深伊紅染色,神經(jīng)細胞及毛細血管周圍空隙增寬,神經(jīng)膠質(zhì)細胞明顯腫脹,間質(zhì)疏松、水腫。

bFGF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),通過與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護作用。當(dāng)腦組織受到各種損傷時,外源性bFGF能通過受損的血腦屏障發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[4]。本實驗顯示缺血即刻給予bFGF,腦組織含水量明顯減少,毛細血管通透性下降。bFGF組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對正常,間質(zhì)水腫輕,神經(jīng)細胞周圍無明顯的空隙,毛細血管周圍的空隙明顯減小。免疫組化法檢測ICAM-1顯示缺血區(qū)雖仍有較多ICAM-1陽性微血管,但較缺血再灌注組相比明顯下降,表明bFGF可抑制缺血再灌注后腦組織ICAM-1的表達,降低血管通透性,減輕缺血區(qū)腦組織水腫。其作用機制目前尚不清楚,有待進一步研究。

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[2]史保中.腦出血的評價指標(biāo)及其研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊,2002,29(3):207-209.

[3]姜亞軍,何家聲,丁德云.腦缺血再灌注期間白細胞黏附機制的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊,1996,4(5):261-263.

[4]Rothlein R,M ainolfi EA,Czajkowski M.A form of circulating ICAM-1 in human serum[J].J Immunol,1991,147(11):3 788-3 793.