冷卻豬肉中假單胞菌生長預(yù)測模型的建立與驗證

唐曉陽，趙 勇，孫曉紅，吳啟華，潘迎捷

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.美國緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系，緬因州04469-5735）

假單胞菌通常被認(rèn)為是引起冷卻肉腐敗的主要微生物[1-2]，因此研究假單胞菌的生長預(yù)測模型對冷卻豬肉貨架期和安全性的預(yù)測與監(jiān)控具有重要意義。傳統(tǒng)的微生物檢測不僅耗時耗力，而且結(jié)果具有滯后性，起不到預(yù)測的作用[3]。采用數(shù)學(xué)模型預(yù)測微生物的生長可以及時有效地預(yù)報微生物的生長情況，從而預(yù)測肉品的安全性和貨架期。筆者選用分離自腐敗冷卻豬肉的6株假單胞菌的混合培養(yǎng)液，研究了假單胞菌在0～10℃下的生長情況，建立生長預(yù)測模型，試圖實現(xiàn)對0～10℃冷藏條件下假單胞菌的生長進(jìn)行快速預(yù)測，為建立冷卻豬肉的貨架期預(yù)測模型提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試的假單胞菌 P1，P2，P3，P4，P5，P6 均分離自腐敗豬肉，P1和P2為惡臭假單胞菌，P3和P4為熒光假單胞菌，P5和P6為莓實假單胞菌。

1.2 菌種活化

將6株菌分別從4℃保存的斜面轉(zhuǎn)接至胰胨大豆胨瓊脂（TSA）斜面，經(jīng)30℃，24 h培養(yǎng)活化后，從此斜面挑取一環(huán)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至胰胨大豆胨瓊脂肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，放入搖床，30℃，180 r/min，培養(yǎng)18 h，將6種菌的培養(yǎng)物等比例混合，以此混合菌液為初始接種物。

1.3 菌培養(yǎng)物的制備

計數(shù)培養(yǎng)基為TSA，生長培養(yǎng)基為TSB，均購于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。向每個18 cm×180 cm的試管中準(zhǔn)確加入9.9 mL TSB培養(yǎng)基，121℃下滅菌20 min，備用。將上述初始接種物進(jìn)行一定的梯度稀釋后，按100μL的接種量接種至含有9.9 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，使10 mL TSB的初始菌數(shù)大約為103～104CFU/mL。并將試管分別放于 0、2、4、7、10℃溫度下培養(yǎng)，每隔一天取出一支試管，用平板計數(shù)法測定菌落總數(shù)[4]。

取樣過程應(yīng)在盡量短的時間內(nèi)完成，以減少溫度波動對試驗結(jié)果的影響。

1.4 一級模型的擬合

一級模型的擬合運(yùn)用Origin軟件（Version 7.5），比較線性模型和修正的Gompertz模型擬合不同溫度下假單胞菌的生長曲線，比較這兩種模型的擬合效果，得出擬合效果更好的模型及其相應(yīng)的一級模型參數(shù)，建立0～10℃下假單胞菌的一級模型。線性模型的表達(dá)式為：

式中Nt為微生物在時間T時的對數(shù)值（lg CFU/mL）；A為隨時間無限減小時的漸進(jìn)對數(shù)值（相當(dāng)于初始菌數(shù)，lg CFU/mL）；k 為生長速率（h-1）。

修正的Gomperts模型[5]是雙指數(shù)函數(shù)，表達(dá)式為：

式中t為時間（h），Nt為t時的菌數(shù)，A為初始菌數(shù)N0（lg CFU/mL），C為最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值（lg CFU/mL），B為在時間點M時的相對最大生長速率（h-1），M即是達(dá)到相對最大生長速率所需的時間（h）。由此可以得出 U（h-1）和 LPD（h）的計算公式如下：

其中e=2.718 2

U為微生物生長的最大比生長速率（h-1），LPD為微生物生長的延滯期（h），MPD為微生物的最大細(xì)胞密度（lg CFU/mL）。

1.5 二級模型的擬合

二級模型的擬合同樣運(yùn)用Origin軟件（Version 7.5）對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，應(yīng)用平方根模型及Arrhenius模型擬合溫度-生長速率平方根曲線，研究溫度對于一級模型參數(shù)的影響。

1.5.1 平方根模型擬合 平方根模型[6]是用來描述環(huán)境因子影響常用的模型，簡單的表達(dá)式為：

其中aμ[（h0.5℃）-1]為U線性回歸的斜率；Tmin是一個假設(shè)的概念，理論上是指微生物生長沒有代謝活動時的溫度（℃）。以上模型的適用范圍是在[Tmin，Topt]，其中Topt是微生物生長的最適溫度。將一級模型求得的U和對應(yīng)的溫度帶入方程（3）即可得出aμ 和 Tmin。

1.5.2 Arrhenius模型擬合 Arrhenius模型[7]也是常被應(yīng)用于描述溫度對微生物的生長速率的影響的模型，方程式如下：

其中Aμ（h-1）為前指數(shù)因子，其作用是使模型能夠擬合最大比生長速率的值；Ea為微生物生長的活化能（kJ/mol）；R 是氣體常數(shù)（8.314 J/mol×K）；T為絕對溫度（K）。運(yùn)用Origin軟件（Version 7.5）擬合實驗數(shù)據(jù)，將一級模型求得的U和對應(yīng)的溫度帶入方程（3）即可得出 Aμ和 Ea。

1.6 模型的驗證

根據(jù)二級模型得出不同溫度下的預(yù)測值為Upredicted，通過實驗得到的數(shù)據(jù)為Uobserved，n為測定次數(shù)。計算偏差因子（bias factor）和準(zhǔn)確因子（accuracy factor）是用來表明模型的預(yù)測值與實驗實測值之間的接近程度，并以此驗證所建模型的準(zhǔn)確性。偏差因子和準(zhǔn)確因子的表達(dá)式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 假單胞菌在不同冷藏溫度下的動力學(xué)模型

采用線性模型、修正的Gompertz模型擬合0～10℃下假單胞菌的生長曲線所得統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

從多重判定系數(shù)R2來看，在0～10℃范圍內(nèi)，僅0℃時，線性模型的R2為0.975 0，隨著溫度的升高，線性模型的R2值隨之下降，到10℃時僅為0.675 7，由此可見，線性模型只適合模擬低溫下（如0℃，2℃）假單胞菌的生長情況，使用范圍有限。而在較高的環(huán)境溫度下，線性模型已不能準(zhǔn)確地模擬假單胞菌的生長情況。修正的Gompertz模型常被用于模擬食品中微生物的生長[8-9]。從表1可以看出，在0～10℃范圍內(nèi)，修正的Gompertz模型的R2均在0.96以上，擬合效果良好。

表1 假單胞菌生長曲線的統(tǒng)計分析R2值

圖1表示的是0～10℃下修正的Gompertz對假單胞菌生長數(shù)據(jù)的擬合曲線。從圖中可以看出，溫度對假單胞菌的生長有明顯的影響。當(dāng)溫度為0、2、4℃時，擬合曲線不呈典型的S型，而在7℃和10℃時，擬合曲線呈典型的S型曲線。并且0、2、4℃時的最大菌數(shù)要小于7℃和10℃時的情況，由此可推測，溫度對于假單胞菌的最大菌數(shù)有一定的影響。

圖1 假單胞菌P1在不同溫度下修正的Gompertz模型擬合曲線

修正的Gompertz模型擬合假單胞菌生長曲線所得模型參數(shù)及特定生長參數(shù)如表2所示。從表2可知，隨著溫度的升高，假單胞菌的最大比生長速率也隨之升高，當(dāng)溫度從0℃升高至10℃時，最大比生長速率由 0.028 4（h-1）升高到 0.126（h-1），增加了近5倍。由此可見，即使在冷藏溫度下，如果超過4℃，假單胞菌的生長速率也會顯著增加，從而導(dǎo)致食品的腐敗變質(zhì)加速。由此可見，在實際的生產(chǎn)流通過程中，環(huán)境溫度一直保持在4℃以下，能更有效地延長食品的貨架期，提高食品的安全性。

而溫度對于微生物延滯期的影響，有相關(guān)文獻(xiàn)表明[10]，延滯期隨著溫度升高而縮短。然而本文中延滯期的變化并不是很明顯，可能是因為在0～10℃這個低溫范圍內(nèi)，溫度的升高對延滯期的影響不大。在2、4和7℃時延滯期出現(xiàn)了負(fù)值，這可能是由于生長前期的數(shù)據(jù)采集不夠所致，應(yīng)適當(dāng)增加前期的取樣次數(shù)，確保采集足夠的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行建模。

由表2的模型參數(shù)值得出0～10℃下假單胞菌的一級模型分別為：

0℃時，Nt=3.878+4.398×exp{-exp[-0.017 6×（t-62.877）]}；

2℃時，Nt=3.557+5.135×exp{-exp[-0.019 6×（t-25.003）]}；

4℃時，Nt=3.438+4.946×exp{-exp[-0.026 3×（t-25.506）]}；

表2 假單胞菌修正的Gompertz模型參數(shù)表

7℃時，Nt=2.63+6.227×exp{-exp[-0.027 9×（t-14.496）]}；

10℃時，Nt=4.227+4.435×exp{-exp[-0.077×（t-19.967）]}。

2.2 溫度對假單胞菌最大比生長速率的影響

修正的Gompertz模型能很好地預(yù)測0，2，4，7，10℃溫度條件下假單胞菌的生長，但無法描述溫度的變化對假單胞菌生長的影響。平方根模型和Arrhenius模型因其使用簡單方便，常被用于描述溫度與微生物特定動力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。

2.2.1 平方根模型擬合 根據(jù)表2所示假單胞菌在0～10℃下的最大比生長速率，運(yùn)用Origin軟件（Version 7.5），采用線性回歸擬合最大比生長速率-溫度（-T），表明溫度與假單胞菌的最大比生長速率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.2 Arrhenius模型擬合 根據(jù)表2所示假單胞菌在0～10℃下的最大比生長速率，運(yùn)用軟件（Version 7.5），采用線性回歸擬合最大比生長速率-溫度（InU-1/T），部分統(tǒng)計分析結(jié)果如表3所示。

從模型的方差分析來看，模型的總體顯著，表明平方根模型能較好擬合0～10℃冷藏條件下假單胞菌的最大比生長速率。由圖2和圖3的擬合結(jié)果可知，Arrhenius模型的R2為0.971 6，高于平方根模型的R20.932 6，則選擇Arrhenius模型為假單胞菌的二級預(yù)測模型。

圖2 假單胞菌的最大比生長速率與溫度間的平方根模型及其90%和95%置信區(qū)間

圖3 假單胞菌的最大比生長速率與溫度間的Arrhenius模型及其90%和95%置信區(qū)間

部分統(tǒng)計分析結(jié)果如表3，從模型的方差分析結(jié)果來看，模型的總體是顯著的，表明Arrhenius模型能夠較好地擬合不同溫度下假單胞菌的最大比生長速率。絕對溫度的倒數(shù)（1/T）與假單胞菌的最大比生長速率的自然對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，lnU-1/T曲線見圖3。

表3 假單胞菌P1的二級模型統(tǒng)計分析結(jié)果

從圖上可以看出，二級模型的預(yù)測值都在此預(yù)測曲線的95%置信區(qū)間內(nèi)，模型的預(yù)測結(jié)果可信。經(jīng)過F檢驗，方程顯著，表明此方程能較好地描述該溫度范圍內(nèi)假單胞菌的最大比生長速率與溫度之間的關(guān)系。所建二級模型如下：

InU=36.579-（91.422/0.008 314 T）），

T∈[273.15，283.15]

2.3 模型的驗證

通過Origin 7.5軟件求得各個溫度下U的預(yù)測值（Upredicted）實測值（Uobserved），并通過計算偏差因子和準(zhǔn)確因子來判斷二級模型對最大比生長速率的預(yù)測效果。越接近于1表示模型的預(yù)測效果越好。一般認(rèn)為偏差因子在0.75～1.25之間，準(zhǔn)確因子一般在1.1～1.9之間[11]，模型即可被接受。筆者所建立的Arrhenius模型的偏差因子和準(zhǔn)確因子分別為1.001和1.026，均接近于1，表明此模型能較好地預(yù)測0～10℃內(nèi)實驗室培養(yǎng)條件下假單胞菌的最大比生長速率。

3 結(jié)論與討論

基于實驗室的前期研究，購置于超市的冷卻肉的初始菌量大多為103～104CFU/mL，選用103～104CFU/mL為液體培養(yǎng)基中的初始接種量。在實際中，由于樣品來源不同，所經(jīng)歷的溫度等條件不同將會導(dǎo)致初始菌數(shù)的不同，初始菌量不同也對食品的貨架期和安全性產(chǎn)生影響，因此，可以進(jìn)一步研究不同初始接種量下微生物的生長情況。

國內(nèi)文獻(xiàn)報道多采用平方根模型[12]建立二級模型，而沒有采用其他二級模型與平方根模型進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明，Arrhenius模型的擬合效果優(yōu)于平方根模型。在今后的研究中，可更多地應(yīng)用Arrhenius模型來建立二級模型。

針對分離自腐敗豬肉的6株假單胞菌的混合培養(yǎng)液進(jìn)行建模，所建立的二級模型為InU=36.579-（91.422/0.008 314 T）），T∈[273.15，283.15]。然而，由于冷卻豬肉中有多種不同的腐敗菌和致病菌。在生產(chǎn)、流通、銷售、貯藏各環(huán)節(jié)中，若溫度控制不當(dāng)，可能引起假單胞菌的大量繁殖。目前的研究主要集中于針對一株假單胞菌的生長數(shù)據(jù)來進(jìn)行建模，然而實際冷卻豬肉中的腐敗假單胞菌主要有熒光、惡臭和莓實假單胞菌，筆者采用6株假單胞菌的混合培養(yǎng)物作為受試菌液，所得的生長模型更加符合實際情況，進(jìn)一步為冷卻豬肉的貨架期預(yù)測模型的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。在建模過程中，如能考慮多菌種的混合培養(yǎng)，如假單胞菌與其他病原菌或與其他的腐敗菌進(jìn)行混合培養(yǎng)來模擬實際冷卻肉品中微生物的生長情況，所建模型將更有實際意義。

常用的曲線擬合軟件如SAS，Statistica，MATA LAB等軟件功能強(qiáng)大，但需要編程，給使用者增添了一定了困難。運(yùn)用Origin軟件（Version7.5），對0～10℃下假單胞菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。Origi軟件（Version 7.5）能自動生成擬合曲線，不需要編程和進(jìn)行初始值的設(shè)定，使用更簡便，可為模型數(shù)據(jù)庫的建立提供方便。

致謝：特別感謝上海海洋大學(xué)朱雯娟、黃婧、項峰峰、成殷同學(xué)在試驗上的幫助。

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