一種篩選染料脫色真菌的新方法——脫色圈法

魏寶陽，賀龍澤，龔思齊，李金龍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.長郡中學(xué)，湖南長沙410000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙410128）

據(jù)國家環(huán)保總局對我國水環(huán)境污染現(xiàn)狀的統(tǒng)計與調(diào)查，我國的江河、湖泊及近海流域已普遍受到不同程度的污染，造成污染加重的主要因素是工業(yè)廢水和生活污水的排放，水污染已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會問題[1]。紡織印染工業(yè)是現(xiàn)代工業(yè)中對環(huán)境造成嚴(yán)重污染的產(chǎn)業(yè)之一[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，紡織印染業(yè)廢水排放量居全國工業(yè)行業(yè)第5位，其廢水排放總量為14.13億t，每年占全國工業(yè)廢水統(tǒng)計排放量7.5%[3]。印染廢水具有水量大、有機污染物含量高、堿度高、色度高、生物降解難、水質(zhì)變化大等特點，屬難處理的工業(yè)廢水之一[4]，印染廢水的脫色處理成為了印染廢水治理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。研究表明，對印染廢水起脫色作用的微生物主要有真菌、細(xì)菌和藻類3種。近年來，有脫色能力的微生物被廣泛發(fā)現(xiàn)并利用[7]，如細(xì)菌中的假單胞桿菌（Pseudomonas），藻類中的普通小球藻（Chlorella valgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），真菌中的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等[5]。為此，筆者設(shè)計了一種從土壤中分離篩選印染廢水處理用微生物的新方法——脫色圈法，旨在篩選對染料有明顯脫色能力的真菌，為處理印染廢水提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤來源：造紙廢水和生活污水等排入瀏陽河的主入口處河岸的土壤。

1.2 試驗儀器

TOMY自動立式滅菌鍋 SS-323（TOMY KDGYOCO.,LTD），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），MJX-160型霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SYC-L1型恒溫?fù)u床（上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司），WF J 7200型可見光分光光度計[尤尼科（上海）儀器有限公司]，UV－2100雙光束紫外可見光分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司），DHG-9070型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），OLYMPUS BX41TF熒光顯微鏡（OLYMPUS CORPORATION TOKYO,JAPAN）。

1.3 培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基的配制方法參考沈萍等[8]，選用改良馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，NH4NO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g/L，pH自然，TOMY自動立式滅菌鍋 121℃、20 min滅菌，自然冷卻至室溫備用。

染料-改良馬丁氏培養(yǎng)基：改良馬丁氏培養(yǎng)基消毒滅菌、冷卻至適溫（65～75℃），加入經(jīng)過濾滅菌處理的一定濃度的孟加拉紅、亞甲基藍(lán)、藏花紅、結(jié)晶紫、孔雀綠。

染料-PDA培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基消毒滅菌，冷卻至適溫，分別加入滅菌處理的一定濃度的孟加拉紅、結(jié)晶紫、藏花紅、伊紅丫橙、孔雀綠和亞甲基藍(lán)。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤微生物的分離與篩選 采用常規(guī)的“10倍稀釋法”：用無菌紙稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中，振搖30 min、靜置30 min，獲得土壤懸液。用1 mL移液管吸取1 mL土壤懸液，注入盛有9 mL無菌水的試管中，充分混勻，得到第一個稀釋液（10-1）；然后，另取一只1 mL移液管吸取1 mL第一稀釋液，注入另一盛有9 mL無菌水的試管中，搖勻，得第二稀釋液（10-2），依此類推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。以上所用三角瓶、試管及1 mL移液管均已滅菌處理。分別取10-4、10-5、10-63個稀釋度的土壤懸液0.1 mL，涂布于含0.3%的孟加拉紅-改良馬丁氏培養(yǎng)基平板（每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)），培養(yǎng)皿倒置，30℃培養(yǎng)48 h，對平板培養(yǎng)基上菌落進(jìn)行初步分離、篩選，得到單菌株。

篩選具有脫色圈的菌落，脫色能力的強弱可以通過以下公式做初步判斷：Hc=R1/R2，其中R1為脫色透明圈的直徑，R2為菌落的直徑，Hc越大的菌初步認(rèn)為脫色能力越強。

1.4.2 黑曲霉固體培養(yǎng)條件下的脫色能力測試接種環(huán)點接斜面菌種于染料-PDA培養(yǎng)基平板中央，30℃培養(yǎng)72 h。染料有孟加拉紅、結(jié)晶紫、藏花紅、伊紅丫橙、孔雀綠和亞甲基藍(lán)，每種染料3次重復(fù)。

1.4.3 黑曲霉液體培養(yǎng)條件下的脫色能力測試染料—馬丁氏液體培養(yǎng)基接種0.1 mL孢子懸浮液，150 r/min，30℃振蕩培養(yǎng)48 h。其中染料分別為孟加拉紅、亞甲基藍(lán)、藏花紅、結(jié)晶紫、孔雀綠，每種染料3次重復(fù)。稱量菌體干重，并對脫色后的溶液用可見光分光光度計測出最大吸收波長處的OD值，以不接種菌體的染料溶液初始OD值為對照，計算脫色率。以脫色率表示菌株對染料的脫色能力[10]。

脫色率=（A-B）/A×100%（A：脫色前染料在最大吸收波長處的OD值；B：脫色后染料溶液在最大吸收波長處的OD值。）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離、篩選及鑒定

將 10-4、10-5、10-63個稀釋度的土壤懸液，分別涂布于孟加拉紅-改良馬丁氏培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48 h后，平板中有的菌落周圍出現(xiàn)了脫色后的透明圈，說明這些菌落可能對染料有脫色作用。對這些菌落進(jìn)行初步分離篩選得到單菌株（見圖1）；其后，挑取少量菌株，純化后接入斜面保藏培養(yǎng)基（改良馬丁氏培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)、擴(kuò)繁保存，供后續(xù)試驗使用（見圖2）。

圖1 脫色菌初篩結(jié)果

圖2 純化后菌落脫色圈

根據(jù)葉世泰等[11]提供的形態(tài)指標(biāo)，初步鑒定該菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）；經(jīng)孟加拉紅-改良馬丁氏培養(yǎng)基平板的初步檢測，黑曲霉菌株生存能力較強，適應(yīng)抑菌能力較強的色素培養(yǎng)基環(huán)境，推測其具有較強的脫色能力。

2.2 黑曲霉固體培養(yǎng)條件下的脫色能力

培養(yǎng)72 h后，各平板出現(xiàn)了不同程度的脫色和抑菌現(xiàn)象，具體見表1。

表1 脫色譜初步測試結(jié)果

抑制菌體生長中，結(jié)晶紫與伊紅丫橙接近，72 h后抑菌率均為78.6%；而孔雀綠培養(yǎng)基的抑菌率高達(dá)為97.1%。72 h后，孟加拉紅、藏花紅和亞甲基藍(lán)的脫色圈很明顯。由此可知，不同的色素對菌體的毒害作用不同，除部分色素對該菌有較強的抑制作用外，色素的毒害作用不大；且黑曲霉的脫色譜較廣，在色素培養(yǎng)基中的適應(yīng)能力也較強，說明該菌有一定的應(yīng)用價值。

2.3 黑曲霉液體培養(yǎng)條件下的脫色能力

孟加拉紅、亞甲基藍(lán)、藏花紅和結(jié)晶紫等染料—馬丁氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h后，分別于546、664和560 nm下測量濾液的OD值，并計算脫色率，結(jié)果見圖3。

在染料—馬丁氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，黑曲霉對不同色素的脫色能力差異顯著，對孟加拉紅和結(jié)晶紫的脫色能力很強，達(dá)93.93%，藏花紅僅為30.26%，亞甲基藍(lán)為57.68%，而菌體的干重均為0.17 g。雖然液體培養(yǎng)條件和固體培養(yǎng)條件有一定的差異，但總體上差別不顯著，這表明可以用固體培養(yǎng)的方法做脫色菌的初篩方法，再通過液體發(fā)酵的復(fù)篩，找到有潛力的脫色菌株。

3 討論

孟加拉紅（又名虎紅鈉鹽，分子式為C20H2Cl4I4Na2O5，結(jié)構(gòu)式見圖4）既是一種染料（染料索引號為C.I.45440），也是一種在真菌分離中廣泛應(yīng)用的細(xì)菌和放線菌的抑菌劑；孟加拉紅分子中既含有氧蒽結(jié)構(gòu)又具有三苯烷結(jié)構(gòu)，表明能降解孟加拉紅的生物可能具有廣泛的染料降解譜[9]；因此，選用孟加拉紅作為菌種脫色處理用染料。

用紫外分光光度計對孟加拉紅染料進(jìn)行全波長掃描（200～800 nm），確認(rèn)其在可見光范圍內(nèi)的最大吸光度的波長為546 nm（圖5），測定所得的OD值以O(shè)D546表示，以此來檢測所篩真菌的脫色效果。

以脫色圈法篩選有脫色能力的真菌，不需要特殊的試劑，方法簡單、費用較低，篩選出的真菌菌體能分泌降解色素的物質(zhì)或富集培養(yǎng)基里的色素。該方法可以作為篩選其他脫色能力的微生物的常用方法。

[1]中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部.2007年全國水質(zhì)環(huán)境質(zhì)量狀況.2009.02.03.http：//www.mep.gov.cn/cont/swrkz/shzl/200902/t20090203_133891.htm.

[2]李家珍.染料染色工業(yè)廢水處理 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.1994.

[3]王建慶，李桂生.節(jié)能減排與我國印染行業(yè)的技術(shù)進(jìn)步[J].染整技術(shù)，2008，（6）：26-30.

[4]戴目成，曹建舞.印染廢水水質(zhì)特征及處理技術(shù)綜述[J].給水排水，2000，6（10）：65-67.

[5]郝魯江，許 平.微生物在印染脫色中應(yīng)用及其機理[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2001，15（2）：52-56.

[6]管 錫，季尚儉，閆 濤.印染廢水三維電解法脫色試驗研究[J].青島建筑工程學(xué)院學(xué)報，2000，21（2）：35-38.

[7]吳贊敏，甕 亮，魏乃福，等.印染廢水脫色菌的培育及脫色工藝的研究[J].2005，42（1）：60-62.

[8]沈 萍，范秀容，李廣武，等.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2004.214-222.

[9]李 孱，白景華，倪 紅，等.染料脫色真菌的分離鑒定及其某些特性的研究[J].湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1996，18（3）：284-288.

[10]金 敏，王新為，宋 農(nóng)，等.白腐菌J-6對五類化學(xué)結(jié)構(gòu)染料的脫色性能[J].環(huán)境污染與防治，2004，26（3）：182-184.

[11]葉世泰，喬秉善，路英杰.中國致敏空氣真菌學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1992.