都柿果酒在釀制過程中總酚和花色苷含量和抗氧化活性

張曉松，孫艷梅，胡振生，李冬梅，馮志彪*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學理學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學研究所，黑龍江 帶嶺 153106）

分布于東北地區(qū)的野生越桔有3種，即紅豆越桔（Vaccinium vitisidaea L.），篤斯越桔（Vaccinium uliginasum L.）和朝鮮越桔（Vaccinium koreanum）。篤斯越桔又名篤斯（都柿）、甸果、地果、龍果、黑豆樹、蛤塘果等，它的果實為漿果，成熟后呈藍紫色，果實酸甜可食。耿星河等測定發(fā)現(xiàn)篤斯越桔的陰干果實中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，有粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、碳水化合物、多種礦質(zhì)元素等，還含有17種氨基酸和多種維生素[1]。研究報道了藍莓果中還含有鞣花酸、鞣花單寧、葉酸、花色素苷等多酚類化合物[2]。都柿果實具有多種疾病防治及保健功能，如：良好的防腦神經(jīng)老化、強心、抗癌等保健功能、由于篤斯越桔為人矚目的營養(yǎng)價值，它已經(jīng)被加工成豐富的果汁、果酒產(chǎn)品出現(xiàn)在市場。篤斯越桔中含有豐富的花色苷類成分，在果汁、果酒加工過程中不添加任何人工色素，果汁、果酒也具有亮麗的紅色。

許多研究表明，因為食品中含有多酚、維生素等具有清除自由基能力的物質(zhì)，所以，每天攝取一定量的水果和蔬菜可以減少患心血管疾病的幾率[3-4]。作為一種多酚類天然色素，花色苷是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑，其淬滅自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍?；ㄉ辗€(wěn)定性差，特別是在中性或堿性pH和加熱的情況下很容易降解。試驗進行了篤斯越桔果酒在加工過程中多酚及花色苷含量和抗氧化活性的變化研究，研究都柿中花色苷和總酚含量與清除自由基能力的相關性，旨在證明都柿果酒中的總酚和花色苷是重要的起抗氧化作用的物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸矢車菊色素（Cyanidin Chloride）（購自Sigma）；果膠酶（購自上海藍季科技發(fā)展有限公司）；啤酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器

7500UV/可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；電子天平（上海天平儀器廠）；超純水器（UPW-20NE,北京厲元電子儀器公司）；恒溫培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)技術開發(fā)有限公司）；果汁加工機（PHILIPS）。

1.3 方法

1.3.1 篤斯越桔果酒加工

1.3.1.1 工藝流程

篤斯越桔果酒加工工藝流程見圖1。

圖1 篤斯越桔果酒加工工藝Fig.1 Technological procedures of juice processing of Vaccinium uliginasum L.

1.3.1.2 工藝說明

①原汁制備：250 g篤斯越桔果用果汁加工機破碎，加2倍蒸餾水，添加0.5 mL H2SO3，沸水浴加熱滅菌1 h，作為原汁備用。②酵母的添加：0.3 g葡萄酒酵母用30 mL五倍稀釋原汁溶解，25℃，保溫20 h，使酵母活化。在H2SO3添加8 h后，接種全部活化酵母。③果膠酶用量：加0.1 g。④調(diào)整成分：加糖15 g。測定原汁酸度為10.57 g酒石酸·L-1。酸度較高，加碳酸鈣2.045 g，調(diào)酸度至7.5 g酒石酸·L-1。⑤ 控溫發(fā)酵：在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度25℃，發(fā)酵7 d。⑥后酵：發(fā)酵醪比重降至1.020時，即將酒放出，濾去皮渣，送往密閉的三角瓶，室溫放置，后酵30 d。比重降到0.993時，發(fā)酵認為完全停止。⑦新酒：后酵液減壓過濾，沸水浴加熱滅菌1 h，罐裝，得新酒。⑧酸度測定方法：用標準氫氧化鈉溶液滴定測定。⑨糖含量測定方法：按照國標還原糖的測定方法定量分析。⑩比重測定方法：用比重計測定。

1.3.2 總酚測定方法（Folin-Ciocalteu試劑法）

Folin-Ciocalteu顯色劑的配制參見文獻[5]。

標準曲線的制作：分別配制8.33、16.7、25.0、33.3、41.7、50 μg·mL-1焦沒食子酸溶液。取如上述濃度焦沒食子酸溶液各1.2 mL，加1.0 mL稀釋2倍的Folin-Ciocalteu顯色劑，加 5 mL，1 mol·L-1碳酸鈉溶液避光放置1 h，測760 nm下的吸光度。繪制標準曲線，總酚含量用焦沒食子酸的重量來表示。

總酚測定方法：取加水適當稀釋的果酒樣液1.2 mL，加1.0 mL稀釋2倍的Folin-Ciocalteu顯色劑，加 5 mL，1 mol·L-1碳酸鈉溶液，避光放置1 h，測在760 nm下的吸光度。

1.3.3 花色苷含量測定方法

花色苷含量以鹽酸矢車菊色素含量表示，鹽酸矢車菊色素用0.1 mol·L-1HCl甲醇溶液溶解成100 μg·mL-1儲液。取少量該儲液，用0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液適當稀釋，掃描其吸收光譜，確定其最大吸收波長。

另取儲液，用0.1 mol·L-1HCl乙醇溶液配成2.5～20 μg·mL-1溶液。在最大吸收波長下測吸光度，繪制工作曲線。果酒樣液用適量0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液稀釋，在最大吸收波長下測吸光度。

1.3.4 清除羥基自由基活性測定方法

參照Fenton反應原理及文獻[6]等方法進行。在一刻度試管中加1.0 mL，60 mmol·L-1Fe2+，1.0 mL，90 mmol·L-1水楊酸-乙醇，1.0 mL，0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液，定容至10 mL。加1.0 mL，20 mmol·L-1H2O2。10 min后，在波長520 nm下測吸光度，該吸光度記為A0。于另一刻度試管中加1.0 mL，60 mmol·L-1Fe2+，1.0 mL，90 mmol·L-1水楊酸-乙醇，適當稀釋果酒加工各階段樣液，定容至10 mL，加 1.0 mL，20 mmol·L-1H2O2，10 min 后，在波長520 nm下測吸光度，該吸光度記為A1。樣液在此條件下，有背景顏色，做一不加H2O2的空白，在波長520 nm下測吸光度記為A2。羥基自由基清除率=1-（A1-A2）/A0。

1.3.5 清除氧自由基活性測定方法

鄰苯三酚自氧化速率的測定：在25℃的恒溫水浴鍋中，將 pH 8.2，Tris-HCl緩沖液和 50 mmol·L-1鄰苯三酚水浴中分別保溫10 min后，取2.8 mL，pH 8.2，Tris-HCl緩沖液，加0.1 mL，50 mmol·L-1鄰苯三酚，搖勻，在420 nm下立即測定，每隔0.5 min測1次吸光度（以pH 8.2，Tris-HCl緩沖液為空白），平行試驗3次，得3組數(shù)據(jù)取平均值，根據(jù)所測數(shù)值繪制時間t-A值曲線。計算抑制率以測定3.0 min平均吸光度（A0）計。

樣品抗氧化能力測定：取 2.8 mL，pH8.2，Tris-HCl緩沖液，加待測樣品0.1 mL，0.1 mL，50 mmol·L-1鄰苯三酚，搖勻，立即同上測定吸光度（A測定）。 同時，取 2.8 mL，pH 8.2，Tris-HCl緩沖液，加適當稀釋的果酒加工各階段樣品0.1 mL，加0.1 mL，0.1 mol·L-1HCl。搖勻，測定420 nm下吸光度（A對照），以消除樣品顏色影響。抑制率（%）=（A0-A1）/A0×100%。式中，A1=A測定-A對照。

2 結果與分析

2.1 總酚測定標準曲線

總酚測定標準曲線參見文獻[7]。

總酚測定標準曲線方程為y=0.032x+0.0197，相關系數(shù)R2=0.9988。y為吸光度，x為焦沒食子酸溶液（μg·mL-1）。

2.2 花色苷含量測定工作曲線

鹽酸矢車菊色素溶液吸收曲線見圖2。

圖2 鹽酸矢車菊色素溶液吸收曲線Fig.2 Absorption curve of cyanidin chloride solution

由吸收曲線得到最大吸收波長為537 nm，所以選用537 nm做測定波長。鹽酸矢車菊色素標準溶液工作曲線見圖3，該方程為y=0.031x+0.0069。相關系數(shù)R2=0.9980。y為吸光度，x為鹽酸矢車菊色素濃度（μg·mL-1）。

2.3 果酒加工過程中總酚和花色苷含量變化

本研究在篤斯越桔果酒加工過程中幾個主要階段（原汁、發(fā)酵2、7 d、后酵30 d和新酒）監(jiān)測總酚和花色苷的含量及其抗氧化能力。

篤斯越桔果酒加工過程中總酚和花色苷的含量變化結果見圖4、5。

圖3 鹽酸矢車菊色素標準溶液工作曲線Fig.3 Standard curve for cyanidin chloride solution

圖4 篤斯越桔果酒加工過程中的多酚含量變化Fig.4 Change of polyphenol content during wine processing of Vaccinium uliginasum L.

圖5 篤斯越桔果酒加工過程中花色苷含量變化Fig.5 Change of anthocyanin content during wine processing of Vaccinium uliginasum L.

其中發(fā)酵2 d時，總酚和花色苷的含量比原汁的含量提高近30%，這可能是因為酵母菌和果膠酶的作用使總酚和花色苷進一步浸出的結果。隨著發(fā)酵的進行，總酚和花色苷的含量逐漸下降，這可能是因為微生物產(chǎn)生的酶促使多酚和花色苷降解。新酒中多酚和花色苷含量較發(fā)酵2 d中的分別減少了16.8%和17.4%。

2.4 清除自由基能力變化

在篤斯越桔果酒加工過程中，果酒清除羥基自由基能力和清除超氧自由基能力變化結果見圖6、7。新酒清除羥基自由基能力和清除超氧自由基能力較發(fā)酵2 d中的分別下降了22.5%和14.9%?？偟膩碚f，篤斯越桔果酒加工過程中，果酒清除羥基自由基能力和清除超氧自由基能力和總酚和花色苷含量變化規(guī)律一致。

圖6 篤斯越桔果酒加工過程中清除超氧自由基能力Fig.6 Change of O2-free radical scavenging activity of Vaccinium uliginasum L.during juice processing

圖7 篤斯越桔果酒加工過程中清除羥基自由基能力Fig.7 Change of OH free radical scavenging activity of Vaccinium uliginasum L.during juice processing

2.5 總酚和花色苷含量與清除自由基能力的相關性分析

篤斯越桔果酒加工過程中，果酒總酚和花色苷含量與清除自由基能力的相關性分析結果見圖8、9。

由圖8、9可知，篤斯越桔果酒加工過程中總酚含量與清除羥基自由基能力相關系數(shù)R2為0.9709?？偡雍颗c清除超氧自由基能力相關系數(shù)R2為0.7976?；ㄉ蘸颗c清除羥基自由基能力相關系數(shù)R2為0.9981，花色苷含量與清除超氧自由基能力相關系數(shù)R2為0.8544。果酒總酚和花色苷含量與清除羥基自由基能力相關性較好，而果酒總酚和花色苷含量與清除超氧自由基能力相關性略差。

圖8 總酚含量與清除自由基能力的相關性分析Fig.8 Relativity ananlysis of content of polyphenol and free radical scavenging activity

圖9 總酚含量與清除自由基能力的相關性分析Fig.9 Relativity ananlysis of content of polyphenol and free radical scavenging activity

Solomon等研究發(fā)現(xiàn)無花果中花色苷和總酚含量與抗氧化能力有較好的相關性[8]；Xu等研究127種黑大豆中花色苷和總酚含量與抗氧化能力，得出結論，黑大豆種皮中的花青素和總酚是重要的起抗氧化作用的物質(zhì)[9]。本試驗相關性分析數(shù)據(jù)證明在篤斯越桔中花色苷和總酚含量與清除自由基能力具有相關性。這個結論與張曉松等都柿儲放過程中的研究結果一致[7]。

3 結論

總的來說，在篤斯越桔果酒釀制過程中，總酚和花色苷含量主要呈不斷減少趨勢。隨花色苷和總酚含量減少，清除羥基或超氧自由基能力隨之減弱。相關性分析數(shù)據(jù)證明，在篤斯越桔中花色苷和總酚含量與清除羥基自由基能力具有較高的相關性。因此，篤斯越桔果汁中花色苷和總酚是重要的起抗氧化作用的物質(zhì)。

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[8]Solomon A,Golubowicz S,Yablowicz Z,et al.Antioxidant activities and anthocyanin content of fresh fruits of common fig(Ficus carica L.)[J].J Agric and Food Chem,2006,54(20):7717-7723.

[9]Xu J R,Zhang M W,Liu X H,et al.Correlation between antioxidation and the content of total phenolic and anthocyanin in black soybean accessions[J].Agricultural Sciences in China,2007,6(2):150-158.