尿素包合法純化ARA的研究

李麗娜，于長(zhǎng)青，韓玉璽

（1.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（大慶））

花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA或 AA）是5，8，11，14-二十碳四烯酸，是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，具有益智健腦，提高視敏度，酯化膽固醇，抑制血小板凝集，降低血液粘度，調(diào)節(jié)血脂和血糖，保護(hù)皮膚，抗炎癥等功能，已經(jīng)在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。

由于ARA具有廣泛的生物活性，其應(yīng)用前景十分看好，而且它的純度越高，價(jià)值就越大。ARA的提取方法很多，如傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法，脂肪酶法等[2-4]。尿素包合法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，藥品、試劑也便宜。在碳鏈長(zhǎng)度相同的情況下，脂肪酸飽和度越高，越容易與尿素包合物，根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，可以將飽和度不同的脂肪酸分開(kāi)，達(dá)到分離純化的目的[5-6]。本研究之前采用CO2超臨界萃取將微生物油脂從發(fā)酵液中提取出來(lái)，并將碳鏈長(zhǎng)度不同的不飽和脂肪酸分開(kāi)，現(xiàn)采用尿素包合法將飽和度不同的脂肪酸分開(kāi)。

1 材料和方法

1.1 原料

經(jīng)CO2超臨界萃取得到的深黃被孢霉YZ-124微生物油脂，ARA含量19.34%。

1.2 試劑

ARA標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）美國(guó)Sigma公司；正己烷（色譜純）、甲醇、乙醇、乙醚、石油醚（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；尿素、氫氧化鈉（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水硫酸鈉（分析純）天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

同時(shí)應(yīng)用氣相色譜分析ARA的純度，為ARA的研究開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1.3 儀器設(shè)備

微量移液器（100～1000 μL）芬蘭雷伯公司；氣相色譜儀（GC 9900型）上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平（JD100-3B）沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；電熱恒溫水槽（DZKW-G）上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢA）鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 微生物油脂的提取

高產(chǎn)菌株YZ-124的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)預(yù)處理，用超臨界CO2對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取。萃取壓力16 MPa、萃取溫度32.5℃，萃取時(shí)間90 min，分離器Ⅰ溫度37.5℃，分離器Ⅱ溫度42.5℃，CO2流量15 g·h-1。從分離器Ⅰ中得到清澈透明、色澤淡黃的微生物油脂，經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去夾帶劑和多余水分，得到的微生物油脂裝入棕色試劑瓶，置于4℃冰箱備用。

1.4.2 油脂的前處理

油脂由脂肪酸甘油三酯組成，各種脂肪酸在甘油碳架上的排列是無(wú)序的，而且空間位阻較大，難以分離。但乙酯型穩(wěn)定性好，因而，尿包時(shí)要先將脂肪酸從甘油三酸酯中解離下來(lái)，進(jìn)行乙酯化處理后再進(jìn)行尿素包合。微生物油脂按一定比例加入3%的NaOH-乙醇溶液，置于脂肪瓶中，在60℃的水浴中加熱回流，得皂化液。冷卻至室溫后，加入適量水使生成的少量皂完全溶解，用10%的HCL溶液酸化混合液至pH=2～3，加正己烷萃取，分層，去下層的水層。有機(jī)相水洗至中性，加入Na2SO4脫水，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑，得到混合脂肪酸或混合脂肪酸乙酯。

1.4.3 尿素包和法純化ARA

一定量的有機(jī)溶劑中加入適量尿素，70℃水浴加熱溶解，待尿素完全溶解后，既得尿素的飽和溶液。在一定量的尿素飽和溶液中加入適量的混合脂肪酸，65℃水浴加熱回流，混合物變成清澈透明的溶液后，室溫冷卻30 min，于一定溫度的冰箱中放置一定時(shí)間。然后減壓抽濾除去尿素晶體及形成的包合物。濾液中加入適量正己烷，用10%的HCl溶液酸化濾液至pH=2-3，加入適量水充分萃取，去下層的水層，把有機(jī)相水洗至中性。加入無(wú)水硫酸鈉脫水，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑，得到高純度的ARA。

1.4.4 氣相色譜分析ARA含量

樣品的處理方法：取微生物油脂20 mg溶于2.5 mL正己烷中，加入0.1 mL 0.5 M的甲醇鈉溶液，室溫下輕搖5 min，然后加入少量的無(wú)水Na2SO4去除水分，靜置1 h后，于3000 rpm下離心3 min，上清液進(jìn)樣。

氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱FFAP（30 m×0.32 mm×0.5 um）；柱初溫為 100 ℃，以8℃·min-1升溫至240℃，然后恒溫至完成分析；汽化室溫度為250℃；載氣流量為48 mL·min-1；氫氣流量為 42 mL·min；空氣流量為 261 mL·min-1；尾吹流量為34 mL·min-1；進(jìn)樣量為4 μL。測(cè)定結(jié)果以面積歸一法計(jì)算ARA的含量。

2 結(jié)果

2.1 尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

為考察尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響，控制反應(yīng)條件為：包合溫度-15℃，包合時(shí)間12 h，分別選擇尿素:混合脂肪酸為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5:1（W:W:W）的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of the quality ratio of urea and fatty acid on the urea inclusion result

由圖1可以看出，ARA含量隨尿素與脂肪酸質(zhì)量比的增加而升高，但后期增加幅度緩慢。尿素與脂肪酸質(zhì)量比為4∶1和5∶1時(shí)，對(duì)ARA的飽和反應(yīng)最好。由方差分析可得，質(zhì)量比為4∶1和5∶1時(shí)，得到的ARA純度差異不顯著，為了兼顧各方面的因素，采用了4∶1的比例，最終得到的微生物油脂中ARA含量為30.9%。其原因?yàn)榘纤枘蛩氐挠昧坎浑S溫度的變化而變化，包合前油脂中其它組分的濃度也不會(huì)影響尿素的用量，脂肪酸和尿素的摩爾比只隨脂肪酸的飽和度不同而不同。但在實(shí)際操作中，如果尿素用量較小，脂肪酸則按其平衡常數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性與尿素絡(luò)合，飽和度高的脂肪酸優(yōu)先形成包合物而沉淀；隨著尿素用量增加，單烯及雙烯脂肪酸也相繼形成包合物析出[7]。

2.2 溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

為考察溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響，控制反應(yīng)條件為：包合時(shí)間 12 h，混合脂肪酸∶尿素∶乙醇為 1∶4∶12（W∶W∶W），分別在 5、0、-5、-10、-15 ℃的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

圖2 溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of the temperature on the urea inclusion result

由圖2可以看出，ARA含量隨溫度的降低先上升后下降，當(dāng)溫度為-15℃時(shí)，ARA含量最高，為32.4%；當(dāng)溫度低于-15℃時(shí)，ARA含量隨溫度的降低而下降，因此選擇包合溫度為-15℃。其原因?yàn)槟蛩匕戏磻?yīng)是一個(gè)放熱的反應(yīng)，降低溫度時(shí)，反應(yīng)向生成尿素包合物的方向進(jìn)行，包合溫度隨不飽和度的增加而降低。結(jié)晶溫度高時(shí)，短鏈或低不飽和的脂肪酸與尿素形成的包合物難以穩(wěn)定，并且不易析出；結(jié)晶溫度低時(shí)，飽和脂肪酸或低不飽和脂肪酸易與尿素形成包合物，但結(jié)晶形成緩慢[8]。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)包合溫度，來(lái)分離飽和度不同的脂肪酸。要包合混合物中的ARA需要較低溫度，但溫度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致DHA等比ARA不飽和度更高的脂肪酸被大量富集，從而降低了ARA在脂肪酸中的含量。

2.3 時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

為考察時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響，控制反應(yīng)條件為：包合溫度-15℃，混合脂肪酸:尿素:乙醇為1∶4∶12（W∶W∶W），分別反應(yīng) 8、10、12、14、16 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the time on the urea inclusion result

由圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ARA含量逐漸增加，但后期ARA含量的提高不明顯，再增加時(shí)間，ARA含量也不能顯著提高。根據(jù)方差分析結(jié)果來(lái)看，包合時(shí)間在16、14和12 h時(shí)ARA含量差異不顯著，綜合考慮，確定包合時(shí)間為12 h。

2.4 對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

為考察溶劑種類對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響，控制反應(yīng)條件為：混合脂肪酸:尿素:溶劑為 1∶4∶12，包合溫度-15℃，包合時(shí)間12 h，分別以95%的乙醇和95%的甲醇作溶劑，純化微生物油脂中的ARA，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 溶劑種類對(duì)尿素包合效果的影響Table 1 Effect of solvent varieties on the urea inclusion result

由表1以看出，在同樣的反應(yīng)條件下，甲醇和乙 醇分別作為尿素包合反應(yīng)中溶解尿素的溶劑，甲醇的效果好于乙醇。而且，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)用甲醇做溶劑時(shí)溶解尿素和回收溶劑都比乙醇要容易一些。但考慮到包合的成本和甲醇的毒性及操作的安全性，尿素包合法富集微生物油脂中ARA仍以乙醇為溶劑較佳。

2.5 條件優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)ARA的純化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal test

表3 尿包法純化ARA的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The Result of the orthogonal test on enriching ARA

由表3可以看出，純化工藝參數(shù)對(duì)ARA濃度的影響主次為：尿素量＞溶劑量＞包合溫度＞包合時(shí)間。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

經(jīng)方差分析，尿素用量對(duì)ARA純度的影響達(dá)到極顯著水平（p<0.01），溶劑相對(duì)質(zhì)量和包合溫度對(duì)ARA純度的影響達(dá)到顯著水平（p<0.05）。對(duì)表4數(shù)據(jù)作圖，試驗(yàn)因素水平對(duì)ARA的濃度的影響直觀趨勢(shì)圖見(jiàn)圖4。

圖4 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析圖Fig.4 Range analysis of the result of orthogonal test

由圖4可以看出：尿素包合反應(yīng)的最佳條件為A3B3C3D2，即脂肪酸∶尿素∶95%乙醇＝1∶4∶12（W∶W∶W），包合溫度為-15℃，包合時(shí)間為12 h時(shí)，產(chǎn)品中ARA的濃度達(dá)到的最高值。

2.6 氣相色譜分析結(jié)果

本研究所采用的毛細(xì)管氣相色譜程序升溫條件，可以將飽和與不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯分開(kāi)。檢測(cè)出的脂肪酸結(jié)果如圖5。

圖5 微生物油脂氣相色譜分析結(jié)果Fig.5 The gas chromatographic analysis result of microbes olein

結(jié)果表明，高產(chǎn)菌株YZ-124的微生物油脂經(jīng)過(guò)尿素包合法純化后，ARA的保留時(shí)間為17.707 min，ARA含量為36.84%，比純化前提高90.49%。

3 結(jié)論

本文采用正交試驗(yàn)確定了尿素包合反應(yīng)的最佳條件為：尿素∶脂肪酸為 4∶1（W∶W）、脂肪酸:乙醇為1∶12（W∶W）、包合溫度為-15 ℃和包合時(shí)間為 12 h。通過(guò)方差分析和單因子效應(yīng)分析得出尿素用量對(duì)ARA純度的影響達(dá)到極顯著水平（p<0.01），溶劑相對(duì)質(zhì)量和包合溫度對(duì)ARA純度的影響達(dá)到顯著水平（p<0.05）。在所選擇的正交試驗(yàn)的因素和水平范圍內(nèi)，各種影響因素對(duì)ARA濃度的影響主次為：尿素量＞溶劑量＞包合溫度＞包合時(shí)間。按照優(yōu)化的包合條件進(jìn)行試驗(yàn)，得到的微生物油脂中ARA含量為36.84%，比純化前提高90.49%。

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