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    尿素包合法純化ARA的研究

    2010-07-04 05:44:58李麗娜于長(zhǎng)青韓玉璽
    關(guān)鍵詞:包合物油脂尿素

    李麗娜,于長(zhǎng)青,韓玉璽

    (1.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,大慶 163319;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(大慶))

    花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA或 AA)是5,8,11,14-二十碳四烯酸,是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì),具有益智健腦,提高視敏度,酯化膽固醇,抑制血小板凝集,降低血液粘度,調(diào)節(jié)血脂和血糖,保護(hù)皮膚,抗炎癥等功能,已經(jīng)在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。

    由于ARA具有廣泛的生物活性,其應(yīng)用前景十分看好,而且它的純度越高,價(jià)值就越大。ARA的提取方法很多,如傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法,脂肪酶法等[2-4]。尿素包合法所需設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,藥品、試劑也便宜。在碳鏈長(zhǎng)度相同的情況下,脂肪酸飽和度越高,越容易與尿素包合物,根據(jù)這個(gè)性質(zhì),可以將飽和度不同的脂肪酸分開(kāi),達(dá)到分離純化的目的[5-6]。本研究之前采用CO2超臨界萃取將微生物油脂從發(fā)酵液中提取出來(lái),并將碳鏈長(zhǎng)度不同的不飽和脂肪酸分開(kāi),現(xiàn)采用尿素包合法將飽和度不同的脂肪酸分開(kāi)。

    1 材料和方法

    1.1 原料

    經(jīng)CO2超臨界萃取得到的深黃被孢霉YZ-124微生物油脂,ARA含量19.34%。

    1.2 試劑

    ARA標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)美國(guó)Sigma公司;正己烷(色譜純)、甲醇、乙醇、乙醚、石油醚(分析純)天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;尿素、氫氧化鈉(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;無(wú)水硫酸鈉(分析純)天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

    同時(shí)應(yīng)用氣相色譜分析ARA的純度,為ARA的研究開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

    1.3 儀器設(shè)備

    微量移液器(100~1000 μL)芬蘭雷伯公司;氣相色譜儀(GC 9900型)上??苿?chuàng)色譜儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A)鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子分析天平(JD100-3B)沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;電熱恒溫水槽(DZKW-G)上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢA)鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 微生物油脂的提取

    高產(chǎn)菌株YZ-124的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)預(yù)處理,用超臨界CO2對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取。萃取壓力16 MPa、萃取溫度32.5℃,萃取時(shí)間90 min,分離器Ⅰ溫度37.5℃,分離器Ⅱ溫度42.5℃,CO2流量15 g·h-1。從分離器Ⅰ中得到清澈透明、色澤淡黃的微生物油脂,經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去夾帶劑和多余水分,得到的微生物油脂裝入棕色試劑瓶,置于4℃冰箱備用。

    1.4.2 油脂的前處理

    油脂由脂肪酸甘油三酯組成,各種脂肪酸在甘油碳架上的排列是無(wú)序的,而且空間位阻較大,難以分離。但乙酯型穩(wěn)定性好,因而,尿包時(shí)要先將脂肪酸從甘油三酸酯中解離下來(lái),進(jìn)行乙酯化處理后再進(jìn)行尿素包合。微生物油脂按一定比例加入3%的NaOH-乙醇溶液,置于脂肪瓶中,在60℃的水浴中加熱回流,得皂化液。冷卻至室溫后,加入適量水使生成的少量皂完全溶解,用10%的HCL溶液酸化混合液至pH=2~3,加正己烷萃取,分層,去下層的水層。有機(jī)相水洗至中性,加入Na2SO4脫水,抽濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑,得到混合脂肪酸或混合脂肪酸乙酯。

    1.4.3 尿素包和法純化ARA

    一定量的有機(jī)溶劑中加入適量尿素,70℃水浴加熱溶解,待尿素完全溶解后,既得尿素的飽和溶液。在一定量的尿素飽和溶液中加入適量的混合脂肪酸,65℃水浴加熱回流,混合物變成清澈透明的溶液后,室溫冷卻30 min,于一定溫度的冰箱中放置一定時(shí)間。然后減壓抽濾除去尿素晶體及形成的包合物。濾液中加入適量正己烷,用10%的HCl溶液酸化濾液至pH=2-3,加入適量水充分萃取,去下層的水層,把有機(jī)相水洗至中性。加入無(wú)水硫酸鈉脫水,抽濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑,得到高純度的ARA。

    1.4.4 氣相色譜分析ARA含量

    樣品的處理方法:取微生物油脂20 mg溶于2.5 mL正己烷中,加入0.1 mL 0.5 M的甲醇鈉溶液,室溫下輕搖5 min,然后加入少量的無(wú)水Na2SO4去除水分,靜置1 h后,于3000 rpm下離心3 min,上清液進(jìn)樣。

    氣相色譜條件:色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱FFAP(30 m×0.32 mm×0.5 um);柱初溫為 100 ℃,以8℃·min-1升溫至240℃,然后恒溫至完成分析;汽化室溫度為250℃;載氣流量為48 mL·min-1;氫氣流量為 42 mL·min;空氣流量為 261 mL·min-1;尾吹流量為34 mL·min-1;進(jìn)樣量為4 μL。測(cè)定結(jié)果以面積歸一法計(jì)算ARA的含量。

    2 結(jié)果

    2.1 尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

    為考察尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響,控制反應(yīng)條件為:包合溫度-15℃,包合時(shí)間12 h,分別選擇尿素:混合脂肪酸為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5:1(W:W:W)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

    圖1 尿素與脂肪酸的質(zhì)量比對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of the quality ratio of urea and fatty acid on the urea inclusion result

    由圖1可以看出,ARA含量隨尿素與脂肪酸質(zhì)量比的增加而升高,但后期增加幅度緩慢。尿素與脂肪酸質(zhì)量比為4∶1和5∶1時(shí),對(duì)ARA的飽和反應(yīng)最好。由方差分析可得,質(zhì)量比為4∶1和5∶1時(shí),得到的ARA純度差異不顯著,為了兼顧各方面的因素,采用了4∶1的比例,最終得到的微生物油脂中ARA含量為30.9%。其原因?yàn)榘纤枘蛩氐挠昧坎浑S溫度的變化而變化,包合前油脂中其它組分的濃度也不會(huì)影響尿素的用量,脂肪酸和尿素的摩爾比只隨脂肪酸的飽和度不同而不同。但在實(shí)際操作中,如果尿素用量較小,脂肪酸則按其平衡常數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性與尿素絡(luò)合,飽和度高的脂肪酸優(yōu)先形成包合物而沉淀;隨著尿素用量增加,單烯及雙烯脂肪酸也相繼形成包合物析出[7]。

    2.2 溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

    為考察溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響,控制反應(yīng)條件為:包合時(shí)間 12 h,混合脂肪酸∶尿素∶乙醇為 1∶4∶12(W∶W∶W),分別在 5、0、-5、-10、-15 ℃的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

    圖2 溫度對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of the temperature on the urea inclusion result

    由圖2可以看出,ARA含量隨溫度的降低先上升后下降,當(dāng)溫度為-15℃時(shí),ARA含量最高,為32.4%;當(dāng)溫度低于-15℃時(shí),ARA含量隨溫度的降低而下降,因此選擇包合溫度為-15℃。其原因?yàn)槟蛩匕戏磻?yīng)是一個(gè)放熱的反應(yīng),降低溫度時(shí),反應(yīng)向生成尿素包合物的方向進(jìn)行,包合溫度隨不飽和度的增加而降低。結(jié)晶溫度高時(shí),短鏈或低不飽和的脂肪酸與尿素形成的包合物難以穩(wěn)定,并且不易析出;結(jié)晶溫度低時(shí),飽和脂肪酸或低不飽和脂肪酸易與尿素形成包合物,但結(jié)晶形成緩慢[8]。因此,可以通過(guò)調(diào)節(jié)包合溫度,來(lái)分離飽和度不同的脂肪酸。要包合混合物中的ARA需要較低溫度,但溫度過(guò)低,會(huì)導(dǎo)致DHA等比ARA不飽和度更高的脂肪酸被大量富集,從而降低了ARA在脂肪酸中的含量。

    2.3 時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

    為考察時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響,控制反應(yīng)條件為:包合溫度-15℃,混合脂肪酸:尿素:乙醇為1∶4∶12(W∶W∶W),分別反應(yīng) 8、10、12、14、16 h,每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

    圖3 時(shí)間對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the time on the urea inclusion result

    由圖3可以看出,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ARA含量逐漸增加,但后期ARA含量的提高不明顯,再增加時(shí)間,ARA含量也不能顯著提高。根據(jù)方差分析結(jié)果來(lái)看,包合時(shí)間在16、14和12 h時(shí)ARA含量差異不顯著,綜合考慮,確定包合時(shí)間為12 h。

    2.4 對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響

    為考察溶劑種類對(duì)尿素包合反應(yīng)的影響,控制反應(yīng)條件為:混合脂肪酸:尿素:溶劑為 1∶4∶12,包合溫度-15℃,包合時(shí)間12 h,分別以95%的乙醇和95%的甲醇作溶劑,純化微生物油脂中的ARA,每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

    表1 溶劑種類對(duì)尿素包合效果的影響Table 1 Effect of solvent varieties on the urea inclusion result

    由表1以看出,在同樣的反應(yīng)條件下,甲醇和乙 醇分別作為尿素包合反應(yīng)中溶解尿素的溶劑,甲醇的效果好于乙醇。而且,試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)用甲醇做溶劑時(shí)溶解尿素和回收溶劑都比乙醇要容易一些。但考慮到包合的成本和甲醇的毒性及操作的安全性,尿素包合法富集微生物油脂中ARA仍以乙醇為溶劑較佳。

    2.5 條件優(yōu)化結(jié)果

    在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交試驗(yàn),對(duì)ARA的純化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

    表2 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal test

    表3 尿包法純化ARA的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The Result of the orthogonal test on enriching ARA

    由表3可以看出,純化工藝參數(shù)對(duì)ARA濃度的影響主次為:尿素量>溶劑量>包合溫度>包合時(shí)間。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表4。

    表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

    經(jīng)方差分析,尿素用量對(duì)ARA純度的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),溶劑相對(duì)質(zhì)量和包合溫度對(duì)ARA純度的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05)。對(duì)表4數(shù)據(jù)作圖,試驗(yàn)因素水平對(duì)ARA的濃度的影響直觀趨勢(shì)圖見(jiàn)圖4。

    圖4 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析圖Fig.4 Range analysis of the result of orthogonal test

    由圖4可以看出:尿素包合反應(yīng)的最佳條件為A3B3C3D2,即脂肪酸∶尿素∶95%乙醇=1∶4∶12(W∶W∶W),包合溫度為-15℃,包合時(shí)間為12 h時(shí),產(chǎn)品中ARA的濃度達(dá)到的最高值。

    2.6 氣相色譜分析結(jié)果

    本研究所采用的毛細(xì)管氣相色譜程序升溫條件,可以將飽和與不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯分開(kāi)。檢測(cè)出的脂肪酸結(jié)果如圖5。

    圖5 微生物油脂氣相色譜分析結(jié)果Fig.5 The gas chromatographic analysis result of microbes olein

    結(jié)果表明,高產(chǎn)菌株YZ-124的微生物油脂經(jīng)過(guò)尿素包合法純化后,ARA的保留時(shí)間為17.707 min,ARA含量為36.84%,比純化前提高90.49%。

    3 結(jié)論

    本文采用正交試驗(yàn)確定了尿素包合反應(yīng)的最佳條件為:尿素∶脂肪酸為 4∶1(W∶W)、脂肪酸:乙醇為1∶12(W∶W)、包合溫度為-15 ℃和包合時(shí)間為 12 h。通過(guò)方差分析和單因子效應(yīng)分析得出尿素用量對(duì)ARA純度的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),溶劑相對(duì)質(zhì)量和包合溫度對(duì)ARA純度的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05)。在所選擇的正交試驗(yàn)的因素和水平范圍內(nèi),各種影響因素對(duì)ARA濃度的影響主次為:尿素量>溶劑量>包合溫度>包合時(shí)間。按照優(yōu)化的包合條件進(jìn)行試驗(yàn),得到的微生物油脂中ARA含量為36.84%,比純化前提高90.49%。

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