菜薹雜交種ISSR和SRAP的指紋圖譜構(gòu)建

冒維維，孫敬東，陳學好

（1.江蘇泰州市作物栽培指導站，225300；2.揚州大學園藝與植物保護學院）

我國大面積栽培的蔬菜，大部分使用了雜種一代。菜薹屬十字花科蕓薹屬作物，具有花期自交不親和的特性，雜種一代的應用較為普遍。為了充分發(fā)揮雜種一代的優(yōu)勢，最根本的是要保持一代雜種的純度。十字花科作物雜交制種過程中由于管理措施不當和自交不親和等而常常產(chǎn)生自交種子，即假雜種，降低雜交種的純度。采用傳統(tǒng)的田間形態(tài)特征檢測種子純度，費工費時，且一些品種之間植物形態(tài)非常接近，很難鑒別。

DNA分子標記技術(shù)的出現(xiàn)，有效地提高了遺傳分析的效率和準確性，已在遺傳研究和育種實踐中發(fā)揮了巨大作用。隨著分子標記技術(shù)的日益成熟和普及，分子標記在品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測等方面也起到越來越重要的作用。迄今，已經(jīng)有多種分子標記技術(shù)應用于多種作物的種子純度鑒定，其中又以RAPD、ISSR、SRAP和AFLP等最為常見[1]。張增翠等[2]利用AFLP技術(shù)構(gòu)建了不結(jié)球白菜矮抗6號的指紋圖譜；尹賢貴等[3]利用RAPD技術(shù)構(gòu)建了番茄品種渝粉109的指紋圖譜；趙麗萍等[4]利用SRAP與AFLP技術(shù)分析了7個蘿卜品種的指紋圖譜；Zhao等[5]利用 ISSR標記構(gòu)建了24個桑品種的指紋圖譜。但到目前為止，尚未見ISSR和SRAP技術(shù)在構(gòu)建菜薹指紋圖譜方面的應用。本研究利用ISSR和SRAP標記技術(shù)對1份菜薹雜交組合進行分析，旨在鑒定出雙親及其雜種一代，作為鑒定雜種真?zhèn)渭胺N子純度的方法，并為開展分子標記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用材料為菜薹雜交組合 T0601×CT07，其T0601為母本，CT07為父本。2006年9月播種于揚州幫達蔬菜研究所試驗田，待幼苗長至5～6片真葉時取嫩葉提取基因組DNA。

1.2 試驗方法

①DNA的提取及檢測 采用改良過的CTAB法提取基因組DNA。

②PCR擴增及產(chǎn)物檢測 ISSR擴增反應體系的總體積為 20 μL，包括 1×PCR buffer，模板 DNA 30 ng，Taq 酶 1 U，dNTP 250 μmol/L， 引 物 0.25 μmol/L，Mg2+2.5 mmol/L。

反應程序為94℃預變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，循環(huán) 35 次，72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳 1 h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察并拍照分析。

SRAP擴增反應體系的總體積為20 μL，包括1×PCR buffer， 模板 DNA 30 ng， Taq 酶 1 U、dNTP 250 μmol/L、上游引物 0.25 μmol/L、下游引物 0.25 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L。

圖1 不同ISSR引物對供試材料的擴增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

用100個ISSR引物和30對SRAP引物對供試材料進行PCR擴增，其中有42個ISSR引物和全部30對SRAP引物均能擴增出清晰的條帶，但大多數(shù)引物的擴增結(jié)果在雙親及雜種之間是一致的，不能起到鑒別的作用。最終篩選出5個ISSR引物（UBC823、UBC843、UBC876、UBC880 和UBC890）和 3對 SRAP 引物（E4-M11、E7-M4和 E10-M8）可將雙親和F1清晰區(qū)分，且重復性好。

2.2 擴增結(jié)果分析

由圖1，2可知，兩種標記技術(shù)共8個（對）引物（UBC823、UBC843、UBC876、UBC880、UBC890、E4-M11、E7-M4和E10-M8）能在材料間表現(xiàn)出多態(tài)。引物UBC823在約1 400 bp、1 000 bp和800 bp處分別擴增出3條雙親的特異帶，在F1中3條特異帶也被擴增出來，表現(xiàn)為雙親間互補特征帶；引物UBC843在約1 700 bp、1 500 bp和900 bp處擴增出3條雙親的互補特征帶，在F1中3條特異帶也均存在；引物UBC876在父本和F1中均約1 600 bp和600 bp處擴增出2條特征帶，而在父本中又擴增出1條約1 500 bp的特異帶區(qū)別于母本和F1；引物UBC880在父本和F1中均約1 700 bp和1 200 bp處擴增出2條特征帶，而在F1中又擴增出1條約1 500 bp的特異帶區(qū)別于其雙親；引物UBC890在父本和F1中均約800 bp處擴增出1條特征帶，而在母本中又擴增出1條1 200 bp的特征帶區(qū)別于父本和F1（圖 1）。

圖2 不同SRAP引物對供試材料的擴增結(jié)果

圖2表明，引物組合E4-M11在約900 bp、750 bp和450 bp處擴增出3條雙親的互補特征帶，在F1中3條特異帶也均存在；引物組合E7-M4在約450 bp和400 bp處擴增出3條雙親的互補特征帶，在F1中3條特異帶也均出現(xiàn)；引物組合E10-M8 在 300 bp、250 bp、200 bp 和 150 bp 之間擴增出4條雙親的互補特征帶，在F1中4條特異帶也被擴增出來。由此可見，8個（對）引物均能對供試材料的雙親和F1進行有效鑒別。

2.3 數(shù)字指紋的建立

根據(jù)上述兩種分子標記指紋圖譜，以1和0分別代表某個等位基因位點擴增DNA條帶的有無，按照從上到下即由大片段向小片段的讀帶方向，將分子標記指紋圖譜轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字符串，即構(gòu)成數(shù)字指紋。為方便建立相應的數(shù)字指紋[6]，可先依照分子標記指紋圖譜繪制直觀的線段示意圖（圖3），再根據(jù)示意圖建立數(shù)字指紋（表1）。從表1可知，雜交種與親本之間以及親本相互之間的多態(tài)可以通過字符串的排列順序而得到清楚的表達。

圖3 E10-M8引物對供試材料的指紋圖譜和指紋圖譜線段示意圖

表1 分子標記指紋圖譜的數(shù)字指紋

3 小結(jié)與討論

DNA指紋圖譜是建立在DNA分子標記技術(shù)基礎(chǔ)上的，能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜。這種電泳圖譜多態(tài)性豐富，具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，就像人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”[7]。指紋圖譜是鑒別品種、品系（含雜交親本、自交系）的有力工具，具有快速、準確等優(yōu)點。因此指紋圖譜技術(shù)非常適合于品種資源的鑒定工作。

ISSR和SRAP分子標記技術(shù)通常都是顯性或共顯性標記[8]，所以父母本具有的特征帶，在雜種F1代中通常也能表現(xiàn)出來，通過檢測F1代是否出現(xiàn)雙親的特異帶，即可進行雜種鑒定。本試驗成功篩選出3個ISSR引物和3對SRAP引物，可擴增出供試材料雙親的互補特征帶；另有2個ISSR引物，也可有效鑒別雙親及其雜種F1。因此，兩種標記技術(shù)均適用于菜薹的指紋圖譜構(gòu)建，都能有效地鑒別雙親及其雜種F1，用于雜種純度的鑒定。本研究利用兩種標記技術(shù)已經(jīng)初步建立了1份菜薹雜交組合的指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜，為今后菜薹雜交種子純度鑒別，實現(xiàn)早期篩選淘汰，為提高育種效率提供了技術(shù)支撐，在分子水平上為新品種的知識產(chǎn)權(quán)保護提供了技術(shù)保障。

[1]王忠華.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應用[J].分子植物育種，2006，4（3）：425-430.

[2]張增翠，侯喜林.不結(jié)球白菜矮抗6號的AFLP指紋鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2004（1）：63-64.

[3]尹賢貴，潘光輝，楊琦鳳，等.番茄品種渝粉109的DNA指紋圖譜構(gòu)建[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2007，20（5）：1 064-1 066.

[4]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等.蘿卜品種指紋圖譜SRAP與AFLP 分析[J].植物研究，2007，27（6）：687-694，714.

[5]Zhao W G,Miao X X,Zang B,et al.Construction of fingerprinting and genetic diversity of mulberry cultivars in china by ISSR markers[J].Acta Genetica Sinica,2006,33(9):851-860.

[6]劉沖，王曙霞，任云英，等.“夏光”、“早夏 16”甘藍雜交種DNA 指紋圖譜的構(gòu)建[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2006，22（1）：31-33.

[7]李長有.DNA指紋技術(shù)的研究進展及應用[J].吉林師范大學學報：自然科學版，2004，25（2）：56-58.

[8]周延清.DNA分子標記技術(shù)在植物研究中的應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.