從血液流變學(xué)的改變分析腎上腺素致血瘀證大鼠模型的建立1)

趙 玲,魏海峰,李雅莉,張 麗,李 林

血瘀證即指人體內(nèi)血脈不暢,血行遲緩澀滯,血液壅阻血脈或離經(jīng)停積的病理生理狀態(tài),是目前臨床上最常見的癥候之一,可見于多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中。血瘀證及活血化瘀療法是近代中西醫(yī)結(jié)合研究中最活躍的領(lǐng)域之一,其中關(guān)于血瘀證動物模型的研制也取得很大的進展。

七情中的“憂怒”為血瘀證常見病因之一,中醫(yī)認為:“氣為血之帥”,氣行則血行,氣止則血止。肝主疏泄,司調(diào)暢氣機。如果肝氣郁結(jié),氣機阻滯,則血行不暢,而致血瘀。中醫(yī)所謂的“肝郁”是指由于高級神經(jīng)活動紊亂而表現(xiàn)的癥候群,其主要病因是情志異常。情志異?？梢饳C體調(diào)控功能失調(diào),內(nèi)環(huán)境失平衡,氣血失和,而致經(jīng)脈瘀阻。在氣滯的病理過程中往往存在著交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控異常,血液中兒茶酚胺類激素含量升高。因此,在以往研究中多采用兒茶酚胺類激素如腎上腺素進行血瘀證的造模。目前常用的腎上腺素短期給藥復(fù)合冰水應(yīng)激的建立血瘀證大鼠模型的造模方式,是一種急性的應(yīng)激狀態(tài),難以體現(xiàn)中醫(yī)血瘀證中緩慢的由氣機郁滯到血瘀的動態(tài)時空的變化過程。本研究采用長期小劑量注射腎上腺素的方法,與以往常用的腎上腺素急性給藥復(fù)合冰水應(yīng)激的造模方法相比較,觀察這種大鼠模型的血液流變學(xué)改變特征。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠,體重240 g～280 g,SPF級,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK-11-00-0008。

1.2 試劑與儀器 鹽酸腎上腺素注射液(Adr),1 mg/m L,由天津金耀氨基酸有限公司提供,國藥準(zhǔn)字H 12020526;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone,PVP),Sigma公司產(chǎn)品;F-8018纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒,由美德太平洋科學(xué)集團提供。LBY-N6B全自動清洗血流變儀及微量血漿測試裝置,LBY-BX3紅細胞變形儀,C2000-2高性能血凝儀,均由北京普利生儀器有限公司提供。DL-4000B冷凍離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 模型建立及分組 大鼠隨機分為6組。空白對照組:與實驗組同批同條件飼養(yǎng),但不注射Ad r,不以冰水浸泡。急瘀1 d組:Ad r 1.8mg/(kg?d),分兩次皮下注射,兩次間隔4 h;在兩次注射Adr之間,將大鼠浸入冰水中5 min,實驗進行1 d。急瘀2 d組:動物處理與急瘀1 d組相同,但實驗進行2 d。慢瘀小劑量組:Ad r 0.1mg/(kg?d),分兩次注射,持續(xù)7 d;不浸泡冰水。慢瘀中劑量組:A dr 0.3 mg/(kg?d),其余同慢瘀小劑量組。慢瘀大劑量組:Adr 0.9 mg/(kg?d),其余同慢瘀小劑量組。各組動物均在最后一次注射Ad r后24 h處死。

1.4 測定指標(biāo)與方法 大鼠禁食8 h后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉3mg/kg麻醉,頸總動脈抽血。

1.4.1 血液黏度測定 取肝素抗凝血0.8m L,用LBY-N 6B全自動血液流變儀,測定全血黏度。以肝素抗凝血1 m L,3 000 r/m in離心10m in,取上清0.2 m L血漿以微量血漿測試裝置檢測血漿黏度。

1.4.2 紅細胞變形指數(shù)、聚集指數(shù)測定 取肝素抗凝血0.15 m L,加15%PVP緩沖液2 m L,混勻;取0.5 m L樣品,然后用LBY-BX 3紅細胞變形儀,測定在切變率600 s-1、800 s-1、1 000 s-1下的紅細胞變形指數(shù)。以肝素抗凝血0.4m L,加15%PVP緩沖液0.1 m L,混勻;取0.5 m L樣品,然后用LBY-BX3紅細胞變形儀測定紅細胞聚集指數(shù)。

1.4.3 血漿纖維蛋白原含量測定 取枸櫞酸鈉抗凝血,3 000 r/m in離心10 min,取上清(血漿)以FIB緩沖液稀釋(1∶9),取稀釋液0.1 m L放于測試杯中,37℃溫育5 min,加入FIB試劑0.05m L,在C2000-2高性能血凝儀測定FIB含量。

2 結(jié) 果

2.1 不同給藥方式、不同濃度腎上腺素對大鼠血液黏度、血漿纖維蛋白原的影響(見表1) 小、中劑量腎上腺素連續(xù)皮下注射7 d,可引起大鼠低、中、高切變率下全血黏度、血漿纖維蛋白原明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),對血漿黏度無明顯影響。而高劑量腎上腺素注射7 d對全血黏度及血漿黏度均無明顯影響。超大劑量腎上腺素(1.8 mg/kg)皮下注射加冰水浸泡5 m in處理1 d或2 d,均可見血漿黏度、血漿纖維蛋白原明顯升高(P＜0.01);處理1 d組可見低切變率下全血黏度的升高(P＜0.05),而對高、中切變率下全血黏度無明顯影響。

表1 腎上腺素致瘀大鼠模型血液黏度的變化(±s)

表1 腎上腺素致瘀大鼠模型血液黏度的變化(±s)

組別n 全血黏度(m Ps?s)10 s-1 60 s-1 150 s-1血漿黏度mPa?s FIB g/L對照組9 12.47±1.90 7.09±0.60 5.26±0.35 0.92±0.02 1.47±0.32急瘀1 d組7 15.17±2.451)7.67±0.79 5.58±0.56 1.05±0.052)3.67±0.212)急瘀2 d組6 14.60±1.67 7.24±0.64 5.31±0.28 1.00±0.052)3.36±0.212)慢瘀小劑量組10 15.71±2.702)8.70±0.862)6.43±0.492)0.91±0.07 2.17±0.282)慢瘀中劑量組9 15.22±2.541)8.26±1.022)6.04±0.562)0.96±0.02 2.35±0.412)慢瘀大劑量組8 12.68±2.71 7.21±0.80 5.30±0.42 0.94±0.03 2.35±0.412)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 不同給藥方式、不同濃度腎上腺素對大鼠紅細胞變形性及聚集性的影響(見表2) 大劑量腎上腺素(0.9 mg/kg)連續(xù)注射7 d,能引起紅細胞變形指數(shù)明顯降低(P＜0.05)。超大劑量腎上腺素(1.8mg/kg)注射加冰水浸泡處理2 d也可見紅細胞變形指數(shù)的降低(P＜0.05)。但不同給藥方式、不同劑量腎上腺素造模,對大鼠紅細胞聚集指數(shù)均無明顯影響。

表2 腎上腺素致瘀大鼠紅細胞變形指數(shù)及聚集指數(shù)的變化(±s)

表2 腎上腺素致瘀大鼠紅細胞變形指數(shù)及聚集指數(shù)的變化(±s)

組別n 紅細胞變形指數(shù)(%)600 s-1 800 s-1 1 000 s-1紅細胞聚集指數(shù)%對照組9 49.13±1.83 51.74±1.87 52.88±1.96 44.59±8.64急瘀1 d組7 48.77±1.59 51.50±1.36 52.70±1.24 45.76±6.15急瘀2 d組6 46.65±1.481)49.75±1.301)51.07±1.201)47.75±6.81慢瘀小劑量組10 49.12±1.69 51.83±1.61 53.08±1.56 46.66±7.18慢瘀中劑量組9 48.38±2.49 50.78±1.89 52.07±1.87 49.87±6.34慢瘀大劑量組8 46.85±2.321)49.64±2.181)50.91±2.131)47.02±4.85與對照組比較,1)P＜0.05

3 討 論

氣機郁滯是中醫(yī)血瘀證的主要成因之一。其中,氣郁和氣滯分別體現(xiàn)了中醫(yī)氣機不暢的不同程度。氣郁多為慢性起病,常由情志不舒,氣機宣而不暢,日久成郁,無力推動血行,發(fā)為血瘀,是一個兒茶酚胺類激素緩慢升高的過程,充分體現(xiàn)了中醫(yī)動態(tài)時空的特征。氣滯常為急性起病,常由暴怒、大怒,導(dǎo)致氣機阻滯不暢,氣滯則血瘀,是一個兒茶酚胺類激素急劇升高的過程,體現(xiàn)了應(yīng)激的過程。二者病因不同,所引發(fā)的血瘀證的程度也不盡相同。根據(jù)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)的論述,血瘀證主要是由于血液的流動性和黏度變化所致[1]。近年來,研究表明,大劑量腎上腺素皮下給藥加冰水應(yīng)激可以引起血液黏度增高等血液流變學(xué)變化[2]和血管內(nèi)皮損傷[3],關(guān)于大劑量腎上腺素加冷刺激快速造成血瘀模型的方法已經(jīng)被廣泛使用,在造模方法的規(guī)范上也進行了一些探索性研究,包括腎上腺素的造模濃度[4]和造模周期[5]等,提出了腎上腺素長期小劑量造模的方法,證明了腎上腺素長期給藥,可以引起血液流變學(xué)的改變和血管內(nèi)皮損傷[6]等變化。但沒有結(jié)合中醫(yī)理論加以闡明。本研究以大鼠為觀察對象,研究了兩種病因所引起的血液流變學(xué)指標(biāo)的變化情況。采用腎上腺素的3個劑量和大劑量腎上腺素結(jié)合冰水應(yīng)激的方法進行比較造模,驗證了氣郁血瘀和氣滯血瘀的理論,也說明了機體腎上腺素增多是血瘀證的主要成因之一。

本研究所采用的小劑量腎上腺素長期注射法,是模擬中醫(yī)氣郁血瘀的理論,通過小劑量腎上腺素持續(xù)興奮交感神經(jīng),引發(fā)肝氣郁結(jié),無力推動血行,久之成瘀。采用的大劑量腎上腺素結(jié)合冰水浸泡的造模方法,是模擬中醫(yī)氣滯血瘀的理論,通過暴怒時機體釋放大劑量的腎上腺素,佐以冰水應(yīng)激,引發(fā)肝氣郁滯,氣滯無力推動血行,發(fā)為急性血瘀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎上腺素0.1 mg/kg和0.3 mg/kg連續(xù)注射7 d,可以引起大鼠全血黏度和纖維蛋白原含量明顯升高。腎上腺素0.9mg/kg連續(xù)注射7 d,能引起紅細胞變形指數(shù)的明顯降低,纖維蛋白原含量明顯升高;而對全血黏度無明顯影響。腎上腺素1.8 mg/kg注射加冰水浸泡處理1 d或2 d,均可見血漿黏度和纖維蛋白原明顯升高;急瘀2 d組還可見紅細胞變形指數(shù)的降低;急瘀1 d組可引起低切全血黏度的升高,而對高切、中切全血黏度及紅細胞聚集指數(shù)無明顯影響。

本研究結(jié)果顯示,小、中劑量腎上腺素連續(xù)注射,主要是引起全血黏度和纖維蛋白原的改變,大劑量腎上腺素連續(xù)注射,主要是引起紅細胞變形指數(shù)和纖維蛋白原含量的改變。超大劑量腎上腺素給藥加冰水應(yīng)激處理1 d,主要是引起血漿黏度、纖維蛋白原和全血黏度的改變,處理2 d主要是引起血漿黏度、纖維蛋白原和紅細胞變形指數(shù)的改變。本研究中血液流變學(xué)指標(biāo)變化的差異,可能與腎上腺素不同劑量和不同給藥方式所引起的機體反應(yīng)不同有關(guān)。腎上腺素給藥量相對小并以慢性給藥,主要是引起全血黏度的變化,提示全血黏度的改變是一個慢性過程,是氣郁引發(fā)的血瘀特征。腎上腺素給藥量相對大,主要是引起紅細胞變形指數(shù)的改變,提示紅細胞變形能力的變化需要大劑量腎上腺素的作用,說明氣滯時大劑量腎上腺素釋放,是引起血管收縮,導(dǎo)致紅細胞變形能力差、血液瘀滯的主要原因。腎上腺素急性給藥加冰水應(yīng)激,主要是引起血漿黏度的變化,說明血漿黏度的改變是一個急性應(yīng)激的變化過程,是氣滯血瘀的表現(xiàn)。

全血黏度、紅細胞變形指數(shù)和血漿FIB含量是血液流變學(xué)改變的代表指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,不同劑量與不同給藥方式的腎上腺素都可引起血液流變學(xué)的部分改變。其中腎上腺素0.3 mg/kg連續(xù)注射7 d(慢瘀中劑量組)引起大鼠全血黏度升高、血漿FIB含量增加、紅細胞變形性有降低的趨勢、紅細胞聚集性有升高的趨勢,體現(xiàn)了血瘀證從血漿到全血到紅細胞功能的動態(tài)時空特征,是較能體現(xiàn)中醫(yī)氣郁血瘀證特征的較好的造模方法。腎上腺素注射1.8mg/(kg?d)加冰水浸泡5m in,實驗進行2 d引起大鼠血漿黏度升高、血漿FIB含量增加、紅細胞變形性降低,可作為氣滯血瘀證動物模型。

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