流式細(xì)胞術(shù)定量檢測外周血單個核細(xì)胞NF-κB的方法探討

郭曉紅,賈永平,姚海東,劉志蘋

核因子-κB(nuclear fac tor-kappa B,NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,處于各種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié),在機體生理和病理條件下發(fā)揮重要功能,日益受到人們重視。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)NF-κB活性變化可能與冠心病的預(yù)測、危險分層及預(yù)后有關(guān),從而為其早期診斷治療、判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。故快速、靈敏、特異地檢測NF-κB活性變化具有重要的臨床意義。本研究通過觀察NF-κB活性與冠心病冠脈病變之間的關(guān)系,探討應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測外周血單個核細(xì)胞NF-κB活性的實驗方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年5月—2007年11月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科確診為冠心病(CHD)的住院患者90例。其中男54例,女36例,年齡45歲～74歲(58.9歲±11.4歲)。根據(jù)病情將冠心病患者分為急性心肌梗死(AM I)組、不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組和穩(wěn)定型心絞痛(SA)組,每組30例。冠心病診斷依據(jù)1979年WHO缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn),排除非冠狀動脈血流動力學(xué)改變引起的缺血,并且經(jīng)冠狀動脈造影(CAG)證實心外膜下至少一支冠脈狹窄≥50%。所有冠心病患者入院后均接受阿司匹林、他汀類、硝酸酯類等治療,高血壓病、糖尿病患者對癥治療,血壓和血糖控制在正常范圍。同時另選CAG結(jié)果正常者30例作為對照組,其中男16例,女14例,年齡44歲～61歲(52.0歲±8.3歲)。所有患者均排除嚴(yán)重心、肝、腎功能不全,急、慢性感染,惡性腫瘤和自身免疫性疾病。冠心病組與對照組年齡、性別、血壓、體重指數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 主要試劑 Cycle TESTTM PLUS DNA試劑盒(美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品),其中包括A液、B液和PI染液;NF-κB p65鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品);FITC標(biāo)記IgG(美國Jackson公司產(chǎn)品);自制紅細(xì)胞裂解液(KHCO31.0 g,NH4Cl 8.3 g,EDTA-Na20.037 g,pH 7.2)。FACSCalibur流式細(xì)胞儀,美國BECTON DICK INSON公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有入選病例取EDTA抗凝靜脈血2 m L,AM I和UA患者在發(fā)病24 h內(nèi)采血。

1.3.2 單細(xì)胞懸液制備 取EDTA抗凝血75μL,加紅細(xì)胞裂解液2m L,室溫靜置25m in～30 min,離心(2 000 r/m in)5m in,PBS漂洗,然后加A液250μL,靜置10 min后加B液200μL,再靜置10 m in后即獲得單細(xì)胞懸液。

1.3.3 染色和計數(shù) 用血紅蛋白吸管吸取單細(xì)胞懸液10μL置載玻片一端,W right-Giem sa染色,鏡下證實制備好的單細(xì)胞懸液符合要求。往制備好的單細(xì)胞懸液中加適量PBS,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0×106/m L。

1.3.4 熒光標(biāo)記 參照Fou lds[2]方法并加以改進(jìn),取單細(xì)胞懸液500μL加NF-κB p65鼠單克隆一抗工作液25μL(1∶10稀釋),輕輕振蕩混勻,室溫孵育1 h,然后加FITC標(biāo)記IgG二抗30μL(1∶100稀釋),輕輕振蕩混勻,避光孵育30 m in,最后加PI染液20μL,輕輕振蕩混勻,避光孵育30 m in,3 h內(nèi)上機檢測。每組實驗均設(shè)陰性對照,陰性對照只加二抗,不加一抗(加等量PBS),余處理同實驗組。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)本 校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀,調(diào)整熒光變異值(CV)＜3%,獲取標(biāo)本,每一個標(biāo)本至少獲取20 000個細(xì)胞數(shù),儲存并以Cell Quest軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)各分析區(qū)的確定 在FSC/SSC散點圖中設(shè)R1門,代表外周血中單個核細(xì)胞區(qū)域;在PI/SSC散點圖中設(shè)R2門,代表PI陽性細(xì)胞核區(qū)域;在NF-κB FITC熒光直方圖中設(shè)M 1,代表在PI陽性細(xì)胞核中NF-κB p65陽性細(xì)胞核所占比例和峰的位置。NF-κB活性變化以其在PI陽性細(xì)胞核中的陽性率表示。

2.2 外周血單個核細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性變化 AM I組和UA組患者的NF-κB活性與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);SA組患者的NF-κB活性與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測冠心病患者外周血單個核細(xì)胞NF-κB活性變化(±s)

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測冠心病患者外周血單個核細(xì)胞NF-κB活性變化(±s)

組別n NF-κB陽性率(%)AM I組30 36.7±8.91)UA組30 12.8±3.41)SA組30 1.8±1.0對照組30 0.8±0.5與對照組比較,1)P＜0.01

3 討 論

NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞,通過調(diào)控多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、生長因子和免疫受體等相關(guān)基因表達(dá)影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此,測定NF-κB活化情況對探討疾病的發(fā)生機制和防治具有重要意義。

在靜止細(xì)胞中,NF-κB以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,被激活后易位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),引起相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]。傳統(tǒng)的檢測方法凝膠遷移率電動分析(EMSA)、免疫化學(xué)方法、ELISA、免疫熒光顯微鏡觀察等各有優(yōu)缺點,如EMSA以同位素標(biāo)記NF-κB特異性寡核苷酸為探針,檢測其DNA結(jié)合活性[4,5]。該方法雖然靈敏度高,但同位素標(biāo)記對人體有較大危害性,且操作繁瑣、費時,結(jié)果重復(fù)性差。免疫化學(xué)方法和免疫熒光顯微鏡觀察[5],雖然方法簡單,但缺乏客觀性。ELISA測量法[6]具有操作簡便、直接半定量、安全等優(yōu)點,但其檢測標(biāo)本為血清或血漿,不能客觀反映究竟是哪些細(xì)胞發(fā)生了活性改變。

流式細(xì)胞術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的細(xì)胞分析技術(shù),廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究,具有快速、精確、高靈敏、多參數(shù)等特點[7]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測冠心病不同病變程度患者外周血單個核細(xì)胞的NF-κB活性變化,探討NF-κB在冠心病發(fā)病中的作用。冠心病的基本病變是動脈粥樣硬化(AS),而炎癥和免疫反應(yīng)的激活是AS發(fā)生、發(fā)展以及斑塊不穩(wěn)定的主要因素[8]。研究表明[9],NF-κB是炎癥過程的主要調(diào)控因子,被激活后可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子(MCP)、血小板源性生長因子(PDGF)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等與AS有關(guān)的調(diào)控基因,從而促進(jìn)AS斑塊的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示AM I組和UA組患者的NF-κB活性明顯高于對照組(P＜0.01),SA組患者的NF-κB活性與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義,NF-κB活性隨病變程度的加重而增高。提示NF-κB可能參與了冠心病的發(fā)病過程,其激活在AS病變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。與國內(nèi)外的一些相關(guān)報道相同[10-12]。

流式細(xì)胞術(shù)最大優(yōu)點就是細(xì)胞的分析檢測均以單個細(xì)胞為基礎(chǔ),通過識別細(xì)胞標(biāo)記物的特異熒光,確定來源細(xì)胞,并且可以快速、準(zhǔn)確地定量分析細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。與傳統(tǒng)的檢測方法相比較,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個核細(xì)胞的NF-κB活性,不僅標(biāo)本來源簡便,而且檢測時間大大縮短,操作步驟簡單,方法靈敏、特異,具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢。但不論何種檢測方法,都應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行綜合評價,才有其實用價值。

[1] 孫承波,吳宗貴,梁春,等.急性冠狀動脈綜合征患者外周血單個核細(xì)胞核因子κB活性的測定及臨床意義[J].中國動脈硬化雜志,2004,12(6):707-709.

[2] Fou lds S.Novel flow cytom etric method for quan tifying nuclear binding of the transcription facto r nuc lear factor kappaB in unseparated human monocytesand polymorphonuclear cells[J].Cy tometry,1997,29(2):182-186.

[3] Abraham E.NF-kappa B activation[J].C rit Care Med,2000,28(4):100-104.

[4] D'Acquistof,Iuvone T,Rombola L,et al.Involvemen t of NF-κB in the regu lation of cyclooxygenase-2 p rotein exp ression in LPS-stimulated J774 macrophages[J].FEBS Lett,1997,418(2):175-178.

[5] Mercie P,Belloc F,Bihlou-Nabera C,et al.Comparative methodologic study of NF-κB activation in cultu red endothelial cells[J].J Lab Clin Med,2000,136(5):402-411.

[6] 郭甫坤,李亦蕾,吳曙光.Sandw ich ELISA法測定NF-κB[J].中國藥理學(xué)通報,2000,16(1):227-228.

[7] 馬文新.流式細(xì)胞儀技術(shù)與原理[J].世界醫(yī)療器械,1998,4(4):28.

[8] Om i H,Okayama N,Shim izu M,etal.Statins inhibit high glucosem ediated neu trophil-endothelial cell adhesion through decreasing surface exp ression ofendothelialadhesionmoleculesby stimulating p roduction of endothelial nitric oxide[J].M icrovasc Res,2003,65(2):118-124.

[9] W ang CH,Lis H,Weisel RD,etal.C-reactive p rotein upregulates angiotensin I recepters in vascular smoothm uscle[J].Circu lation,2003,107(13):1783-1790.

[10] 舒平,劉迪,周惠云.急性冠狀動脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞核因子κB活性的變化及其意義[J].中國急救醫(yī)學(xué),2005,25(8):556-558.

[11] Wilson SH,Best PJ,Edw ards WD,et al.Nuclear facto r-κappaB immuno reactivity is p resent in human coronary p laque and enhanced in patients with unstab le angina pectoris[J].A therosclerosis,2002,160(1):147-153.

[12] 于景彬.急性冠脈綜合癥患者NF-κB、CPR活性及干預(yù)治療的臨床研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué)博士學(xué)位論文,2007:1-35.