川芎嗪與人血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)研究1)

張愛(ài)平,楊錦艷,王 麗,楊 紅,鄭茂東

川芎嗪(TMP)是從植物川芎根莖中提取分離得到的生物堿單體,具有活血化瘀,抑制血小板聚集、鈣通道阻滯和血栓素的合成,降低血漿內(nèi)皮素水平等作用,對(duì)缺血性腦血管疾病具有良好的療效[1]。

人血清白蛋白(HSA)是血液中的主要蛋白[2]。研究中藥分子與蛋白質(zhì)[3]的結(jié)合機(jī)制有利于深入了解中藥的藥效。國(guó)內(nèi)外有關(guān)天然藥物分子特別是中藥有效成分與蛋白的相互作用研究領(lǐng)域尚處于起步階段且目前的研究工作主要集中在藥物-蛋白質(zhì)二元體系,而有關(guān)金屬離子對(duì)藥物-蛋白質(zhì)二元體系的影響的研究較少,研究?jī)?nèi)容系統(tǒng)性不夠,更深層次的規(guī)律尚未得到揭示。因此,開(kāi)展中藥分子-蛋白質(zhì)多元體系的研究具有重要意義。

采用紫外光譜法、熒光光譜法和同步熒光光譜法相結(jié)合的分析方法,在模擬人體生理?xiàng)l件下,研究TMP與HSA的相互作用,并探討共存金屬離子對(duì)TMP與HSA相互作用的影響,為揭示TMP作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Cary Eclipse熒光光度計(jì)(Peltier電子恒溫裝置,美國(guó)瓦里安公司);TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);Biohit加樣器(芬蘭百得公司);pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);HSA(美國(guó)Sigma公司);磷酸川芎嗪(中國(guó)藥品生物制品檢定所);MgCl2、CoCl2、CuCl2、ZnCl2均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 配制0.02 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(pH7.40,內(nèi)含0.15 mol/L NaCl),然后分別用該緩沖溶液配制1.79×10-4mol/L HSA溶液和5.80×10-4mol/L的TM P溶液。

1.2.1 紫外光譜的測(cè)定 固定HSA溶液的濃度,逐漸增加TMP溶液的濃度,在TU-1901紫外分光光度計(jì)上記錄200 nm～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外光譜。

1.2.2 熒光光譜的測(cè)定 移取2.0 mL 1.79×10-6mol/L HSA溶液于1 cm石英池中,用可調(diào)式移液器逐次加入TMP溶液進(jìn)行熒光滴定,混合均勻后,以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng),在Cary Eclipse熒光光度計(jì)上記錄290 nm～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.2.3 同步熒光光譜的測(cè)定 固定HSA溶液的濃度,逐漸增加TMP溶液的濃度,分別在△λ=15 nm和△λ=60 nm下掃描熒光激發(fā)光譜,分別得到HSA中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的同步熒光光譜。

2 結(jié) 果

2.1 TMP與HSA結(jié)合的紫外光譜

2.1.1 TMP與HSA的結(jié)合常數(shù)K 加入TMP后,HSA發(fā)生減色效應(yīng),表明反應(yīng)前后HSA所處的微環(huán)境發(fā)生改變,TMP與HSA發(fā)生相互作用形成復(fù)合物,從而引起HSA紫外吸收光譜的變化。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度TMP與HSA相互作用的紫外差譜圖

利用Scatchard[4]模型和公式:

(A0-A)-1=A0-1+K-1A0-1[Q]-1

式中:A0——TMP與 HSA作用前的紫外強(qiáng)度;

A——TM P與 HSA作用后的紫外強(qiáng)度;

[Q]——TMP濃度。

以(A0-A)-1對(duì)[Q]-1作 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,由該圖的斜率和截距,求得TMP與HSA的結(jié)合常數(shù)K=1.57×104L/mol,相關(guān)系數(shù)r=0.9983。詳見(jiàn)圖2。

圖2 TMP與HSA相互作用的 Lineweaver-Burk圖

2.1.2 金屬離子與TMP結(jié)合比的確定(見(jiàn)圖3) 以279 nm處的吸光度A對(duì)TMP與金屬離子的摩爾比r作圖,結(jié)果見(jiàn)圖4。由滴定曲線可以看出,A隨r的增加而增加,在r接近1.0時(shí)出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折,表明金屬離子 Mg2+、Co2+、Zn2+、Cu2+均與TMP形成1∶1的配合物。

圖3 金屬離子對(duì)TMP滴定曲線

2.2 TM P與HSA作用的熒光分析

2.2.1 TM P對(duì)HSA熒光猝滅機(jī)制的確定 本文所用的熒光強(qiáng)度均為校正后(扣除川芎嗪的熒光強(qiáng)度和考慮稀釋效應(yīng))的值。HSA在340 nm處出現(xiàn)最大熒光峰,其熒光強(qiáng)度被逐漸敏化,扣除 TMP的熒光后,發(fā)現(xiàn)HSA的熒光被TMP有規(guī)律地猝滅。隨著TMP濃度的增加,HSA的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度逐漸減弱,同時(shí)伴隨著峰位的明顯藍(lán)移,最大藍(lán)移幅度超過(guò)10 nm。由此表明TM P與HSA發(fā)生結(jié)合作用,HSA的構(gòu)象可能發(fā)生變化。這與紫外測(cè)定結(jié)果相吻合。詳見(jiàn)圖4。

圖4 308 K時(shí)TMP對(duì)HSA熒光猝滅圖

熒光猝滅機(jī)制[5]通常分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移。假設(shè)TMP對(duì)HSA熒光的猝滅是由分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅,則按照 Stern-Volmer方程[6]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

式中:F0——蛋白質(zhì)和猝滅劑作用前的熒光強(qiáng)度;

F——蛋白質(zhì)和猝滅劑作用前后的熒光強(qiáng)度;

[Q]——猝滅劑的濃度;

Ksv——?jiǎng)討B(tài)猝滅常數(shù);

Kq——雙分子猝滅速率常數(shù);

τ0——猝滅劑不存在時(shí)物質(zhì)的熒光平均壽命。

相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定在298K和308K下TMP對(duì)HSA的熒光猝滅情況,由于生物大分子熒光平均壽命大約為10-8s[7],各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1 010L/(mol?s),TMP對(duì)HSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于此值,且隨著溫度的升高猝滅速率常數(shù)降低,說(shuō)明TMP對(duì)HSA猝滅機(jī)制是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,而不是由分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅。詳見(jiàn)表1。

表1 TMP與HSA的Stern-Volmer常數(shù)

2.2.2 TMP與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、結(jié)合常數(shù)K的計(jì)算 在靜態(tài)猝滅作用中,熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由靜態(tài)猝滅公式表示:以lg(F0-F)/F對(duì)lg[Q]作圖,由直線的截距、斜率求得:298K,K=1.83×104L/mol,n=1.06,相關(guān)系數(shù) r=0.996 7;308K,K=1.58×104L/mol,n=1.05,相關(guān)系數(shù) r=0.998 5。由此推測(cè)TMP與HSA可能僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。詳見(jiàn)圖5。

圖5 不同溫度下TM P對(duì)HSA的雙對(duì)數(shù)圖

2.2.3 TMP與HSA色氨酸殘基間的距離的計(jì)算 根據(jù)F? ster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)制,結(jié)合HSA的熒光光譜和TMP的紫外吸收光譜的重疊圖[9](見(jiàn)圖6),求得298K和308K下兩光譜重疊區(qū)的重疊積分值分別為4.95×10-16L/(mol?s)和7.34×10-16L/(mol?s)。從而求得非輻射轉(zhuǎn)移效率E為0.0040和0.0079、臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0為1.49nm和1.59 nm及供體和受體之間的距離r為3.74 nm和3.55 nm。

圖6 298K和308K時(shí)T MP的吸收光譜(a)與 HSA的熒光光譜(b)的重疊光譜圖

2.2.4 TM P與HSA結(jié)合的熱力學(xué)性質(zhì) 藥物與蛋白的作用力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。相同實(shí)驗(yàn)條件下分別測(cè)定在298K和308K下TM P與HSA作用的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)?！鱮Hm＜0,△rSm＞0,表明TMP與HSA的相互作用力主要為靜電作用力。Ross等[10]認(rèn)為△rSm＞0是疏水作用力存在的標(biāo)志,因此推斷也存在一定的疏水作用力。詳見(jiàn)表2。

表2 TMP與HSA結(jié)合熱力學(xué)常數(shù)

2.2.5 四種金屬共存金屬離子對(duì)TMP與HSA結(jié)合常數(shù)的影響(見(jiàn)表3) M g2+離子的存在使TMP與HSA的結(jié)合常數(shù)減小;而Co2+、Zn2+、Cu2+離子的存在增大了 TMP與 HSA的結(jié)合常數(shù)。

表3 共存金屬離子對(duì) TMP與HSA結(jié)合常數(shù)的影響

2.2.6 TM P對(duì)HSA構(gòu)象的影響(見(jiàn)圖7) 酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時(shí)被猝滅,色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低更多,推測(cè)TMP與HSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。色氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移,酪氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)基本不變。表明TM P的加入使色氨酸殘基附近的極性降低,疏水性環(huán)境增強(qiáng),說(shuō)明HSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖7 TM P與HSA作用的同步熒光光譜圖

3 討 論

由藥物分子的結(jié)構(gòu)和疏水性可知,TM P分子脂溶性強(qiáng),水溶性差。HSA的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu),幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部,構(gòu)成疏水腔[11]。推測(cè)TMP可能主要通過(guò)靜電作用力及一定的疏水作用力結(jié)合在HSA的疏水腔內(nèi)。

人體內(nèi)存在許多金屬離子,當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)后,會(huì)與這些金屬離子結(jié)合從而影響藥物與血清白蛋白的結(jié)合。由于M g2+與TMP之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)作用,減小了TMP與HSA的結(jié)合常數(shù),縮短TMP在血漿中的儲(chǔ)留時(shí)間,增大TMP的最大作用強(qiáng)度,適于短期內(nèi)提高TMP藥效的臨床治療;而Co2+等金屬離子的存在增大了TMP與HSA的結(jié)合常數(shù),推測(cè)可能是金屬離子與TMP形成的配合物改變了TMP的性質(zhì),使TMP更容易與HSA結(jié)合[12]。從臨床醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的角度考慮,這些金屬離子的存在使TMP在血漿中的潴留時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng),釋放更緩慢,藥效更持久,減小TMP的毒性[13]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探討TMP的藥理、藥效和體內(nèi)代謝機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1] 任志強(qiáng),孫蘭軍.川芎嗪的心血管藥理作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(5):570-572.

[2] Cartery C,He X M,Munson S H,et al.Three-dimensional structure of human serum albumin[J].Science,1989,244(4909):1195-1198.

[3] Ajay KS,Samir KP.Resonance energy transfer and ligand binding studies on pH-induced folded states of human serum albumin[J].J Photochemi Photobio B:Biolo,2008,90(3):187-197.

[4] Scatchard G,Scheiberg II,Armstrong S H.Physical chemistry of protein solutions(Ⅳ):The combination of human serum albumin with chloride ion[J].J Am Chem Soc,1950,72:535-540.

[5] Bogdan M,Pirnau A,Floare C,et al.Binding interaction of indomethacin with human serum albumin[J].J Pharm Biomed Anal,2008,47:981-984.

[6] 楊頻,高飛.生物無(wú)機(jī)化學(xué)原理[M].第2版.北京:科學(xué)出版社,2002:322-331.

[7] 王麗,張愛(ài)平,楊錦艷,等.燈盞乙素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].中國(guó)藥物與臨床,2007,7(9):667-669.

[8] Lakowicz JR,Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen:Probe for structural in acromolecules[J].Biochem,1973,12:4161-4170.

[9] 周能,梁逸曾,王平,等.二氫氯噻與牛血清白蛋白的相互作用特征[J].分析試驗(yàn)室,2008,27(2):30-33.

[10] Ross DP,Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:Forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20:3096-3099.

[11] Ulrich K H.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin[J].Pharmacol Rev,1981,33(1):17-53.

[12] 張國(guó)文,闕青民,潘軍輝.葛根素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27(9):1784-1787.

[13] 伍欽,劉玲玲,姚培.Cu(Ⅱ),Ni(Ⅱ)存在條件下鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2006,25(4):48-51.