缺血性卒中模型大鼠腦組織OMgp的表達(dá)及中藥干預(yù)作用

王中琳

影響缺血性卒中神經(jīng)再生和重塑的因素主要包括促進(jìn)因素和抑制因素,而抑制因素在神經(jīng)再生過程中扮演著更為重要的角色,能否有效解除抑制效應(yīng)是中樞神經(jīng)再生的關(guān)鍵[1]。迄今少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)是已發(fā)現(xiàn)的主要的抑制軸突生長的蛋白之一。前期研究表明[2],滋補(bǔ)肝腎中藥首烏仙海片可誘導(dǎo)缺血性卒中神經(jīng)功能重塑,促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生。本研究通過觀察首烏仙海片干預(yù)局灶性腦缺血模型大鼠腦組織中OMgp含量的變化,進(jìn)一步探討中藥在腦梗死后腦功能重塑中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和分組 雄性 SD大鼠240只,體質(zhì)量250 g～300 g,山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):魯動(dòng)質(zhì)字0002342。240只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、藥物組,并根據(jù)腦缺血病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個(gè)亞組,每個(gè)亞組各為 12只。

1.1.2 藥物與試劑 首烏仙海片主要藥物有制首烏、仙靈脾、海馬、桑寄生、草決明等,由山東魯信藥業(yè)有限公司提供,批號(hào)2007030701,并按照成人劑量的20倍[9 g/(kg?d)]將其制成水溶液,濃度為0.9 g/mL(10 mL/kg),置于4℃冰箱中備用。OMgp單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及處理 按Longa等[3]的方法稍加改進(jìn)行大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)(MCAO)制作局灶性腦缺血模型。正常對(duì)照組:不做任何干預(yù)。假手術(shù)組:線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈但不栓塞大腦中動(dòng)脈。模型組:線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞造模,不進(jìn)行藥物干預(yù)。藥物組:行線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞造模,造模成功24 h后給予首烏仙海片。MCAO模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]:0分,無神經(jīng)缺損表現(xiàn);1分,對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展;2分,向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒;4分,不能行走,意識(shí)喪失。動(dòng)物清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,1分～3分為納入標(biāo)準(zhǔn),0分和4分者剔除。于造模成功24 h后給藥,藥物組灌胃給予首烏仙海片水溶液10 mL/kg,各對(duì)照組分別給予10 mL/kg蒸餾水灌胃,每日1次,每周連續(xù)給藥6 d,停1 d,并于取材當(dāng)天停藥。在取材的各時(shí)間點(diǎn),3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后,4%多聚甲醛PBS灌注固定取腦,然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規(guī)脫水浸蠟包埋,予正中隆起水平在切片機(jī)上行4 μ m連續(xù)冠狀切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水;30%H2O21份+蒸餾水10份混合,室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;熱修復(fù)抗原:將切片浸入 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),電爐加熱至沸騰后斷電,間隔10 min后,反復(fù) 1次,自然冷卻后用 PBS洗滌2次;滴加 5%BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗;滴加兔抗鼠OMgp一抗(1∶50),4℃過夜,PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃20 min。PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加試劑SABC,37℃20 min,PBS洗 5 min×4次;DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,蒸餾水洗滌;脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色陰性對(duì)照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗,其余步驟同上,以檢查OMgp免疫反應(yīng)的特異性。

1.2.3 圖像分析 切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下,隨機(jī)選10個(gè)視野,運(yùn)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,記錄平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)用SAS 8.1版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果(見表1)

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)OMgp表達(dá)比較(±s)

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)OMgp表達(dá)比較(±s)

組別 3 d 1周 2周 4周 6周正常對(duì)照組 9.19±1.83 7.42±1.24 8.03±1.37 8.46±1.81 9.06±2.82假手術(shù)組 8.20±1.27 7.86±1.61 9.14±1.72 8.72±2.02 9.31±1.42模型組 18.61±2.691) 23.62±4.631) 34.04±4.801) 31.65±4.401) 25.23±4.121)藥物組 15.41±2.352) 18.81±3.692) 25.00±4.713) 19.77±3.693) 19.62±4.333)與正常對(duì)照組同時(shí)間比較,1)P＜0.01;與模型組同時(shí)間比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

中樞神經(jīng)再生失敗的主要原因是缺乏適合的微環(huán)境[4],抑制軸突再生蛋白的存在是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的主要障礙之一,其中損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘來源的抑制性蛋白對(duì)軸突再生的抑制作用已成為當(dāng)前軸突再生研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,現(xiàn)已證實(shí)OMgp對(duì)軸突再生有顯著抑制作用,對(duì)其進(jìn)行有效地干預(yù),能夠促進(jìn)神經(jīng)重塑,修復(fù)缺損的神經(jīng)功能[5]。

OMgp是少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白,含有433個(gè)氨基酸殘基。1990年研究人員用編碼OM gp的cDNA克隆篩選人基因組DNA文庫,得到了人OMgp基因。通過基因組克隆與分裂中期細(xì)胞雜交,將人的OMgp基因定位于17號(hào)染色體的q11～12處[6]。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,OMgp基因是 NF1基因的一個(gè)內(nèi)含子,過表達(dá) OMgp的NIH3T3細(xì)胞生長速度明顯減緩,細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在G1期受阻,OMgp可阻礙有絲分裂信號(hào)途徑而發(fā)揮生長抑制作用[7],證明了OM gp作為髓鞘相關(guān)蛋白能抑制軸突生長,導(dǎo)致生長錐的坍塌。體外培養(yǎng)條件下OM gp對(duì)多種神經(jīng)細(xì)胞均有生長抑制作用,如大鼠海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及NG108和PC12細(xì)胞系等,將OMgp和背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)可觀察到明顯的生長錐崩解現(xiàn)象[8]。Benxiu等[9]通過對(duì)OMgp基因敲除的大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的觀察,發(fā)現(xiàn)其軸突再生及神經(jīng)功能的恢復(fù)較野生型大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,進(jìn)一步明確了OMgp對(duì)軸突再生的顯著抑制。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大鼠腦梗死后其腦組織內(nèi)OMgp在早期即成高表達(dá),并逐漸增高,于2周時(shí)達(dá)到高峰,2周后逐漸下降,但直至6周時(shí)表達(dá)也明顯高于正常對(duì)照組,且各時(shí)相OMgp的表達(dá)與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？梢奜M gp在腦梗死后較長時(shí)間處于高表達(dá)狀態(tài),這可能是中樞神經(jīng)損傷后再生困難的一個(gè)主要原因。

近年來有關(guān)中藥誘導(dǎo)中樞神經(jīng)再生的研究均是著眼于促進(jìn)神經(jīng)生長正性調(diào)節(jié)因子的表達(dá),而對(duì)能否下調(diào)抑制因素的表達(dá)則鮮有報(bào)道。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腦梗死的發(fā)生病機(jī)關(guān)鍵為肝腎虧虛,其治療也當(dāng)立足調(diào)補(bǔ)肝腎。首烏仙海片由何首烏、仙靈脾、海馬等組成,此方補(bǔ)腎精以生髓,補(bǔ)肝木以養(yǎng)春生之氣,意在生髓以充腦。本研究探討首烏仙海片對(duì)腦梗死模型大鼠OMgp表達(dá)的影響,結(jié)果表明,藥物組大鼠腦梗死后OMgp在各時(shí)相的表達(dá)均顯著低于同期模型組,說明首烏仙海片可通過抑制神經(jīng)生長負(fù)性調(diào)控因子的表達(dá)對(duì)腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生有促進(jìn)作用。

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