側(cè)腦室注射STZ對大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬tau蛋白AD特異性位點磷酸化增加的影響

第五永長,辛馥伶,李 敏,趙 娜,苗迎春,時 晶

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性記憶認知損害和智能障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前公認的AD核心病理特征為大腦局部,尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變,細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和細胞外老年斑(SP)沉積。然而,AD的病因和確切發(fā)病機制目前仍不清楚。葡萄糖代謝紊亂和能量生成減少與淀粉樣蛋白沉積以及tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān),可能促進了AD的發(fā)生。鏈脲佐菌表(STZ)側(cè)腦室注射已被證實可以引起大鼠腦持久的葡萄糖代謝紊亂、能量生成障礙伴海馬乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性降低和氧化應(yīng)激反應(yīng)以及學(xué)習(xí)記憶障礙[1],然而其與AD病理改變的聯(lián)系未得到進一步實驗證實。本實驗進一步觀察了STZ側(cè)腦室注射對大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬組織tau蛋白AD特異性磷酸化位點Ser422的磷酸化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,體重(250±20)g。隨機分成假手術(shù)組、STZ側(cè)腦室注射模型組,每組18只。實驗過程中動物自由攝食和飲水(術(shù)前禁食除外),室溫22℃ ～ 26℃,濕度為28%～30%。

1.2 藥品與試劑 鏈脲佐菌素:Sigma公司;抗體:pS214(western blot檢測及免疫組化檢測的一抗分別購自Biosource和Abcam公司)。

1.3 ICV-STZ擬 AD模型制備 參考 Sharma等[2]方法,所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后,固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上,常規(guī)消毒皮膚,正中矢狀切口,分離骨膜,錐顱器鉆開顱骨,暴露硬腦膜。除假手術(shù)組外,其余動物均用微量注射器每側(cè)側(cè)腦室各注射 STZ約 18 μ L(3 mg/kg,注射前將STZ溶于人工腦脊液,濃度為25 mg/mL)。坐標(biāo)參考《大鼠腦立體定向圖譜》[3]:前囟后1.5 mm,矢狀縫左右旁開1.5 mm,腦表面下3.5 mm。第3天重復(fù)注射,劑量同前。假手術(shù)組以等量人工腦脊液替代STZ。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)21 d后行為學(xué)測試并處理第一批,31 d后行為學(xué)測試并處理第二批動物。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測試 采用Morris水迷宮試驗法。

1.5 腦組織樣品處理 于行為學(xué)測試完畢后,分別于、兩個時間點選取動物,灌注固定,按4 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。迅速插導(dǎo)管于左心室至升主動脈并固定,同時剪開右心耳。快速灌注生理鹽水100 mL至肝臟完全變白,右心室流出澄清液體后,更換4%多聚甲醛先快后慢繼續(xù)灌注30 min,然后斷頭,完整取出鼠腦,置固定液中,24 h后石蠟包埋切片。每只大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)后連續(xù)冠狀切片,放入0.01 mol/L PBST的溶液中進行免疫組化染色。

Western-blot蛋白印跡檢測取用新鮮腦組織置液氮中速凍后保存于-70℃冰箱。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)測試結(jié)果(見表1、表2)

表1 造模21 d后兩組定位航行試驗結(jié)果(±s)

表1 造模21 d后兩組定位航行試驗結(jié)果(±s)

組別 n 平均逃避潛伏期(s)第21天 第22天 第23天游泳距離(cm)第21天 第22天 第23天假手術(shù)組 6 57.82±9.86 40.36±13.06 19.49±11.98 703.15±191.96 521.56±218.58 86.21±139.44模型組 9 107.23±14.961) 96.14±25.261) 79.26±18.161) 1 261.83±314.351)1 039.38±229.341)756.38±196.551)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01

表2 造模31 d后兩組定位航行試驗結(jié)果(±s)

表2 造模31 d后兩組定位航行試驗結(jié)果(±s)

組別 n 平均逃避潛伏期(s)第31天 第32天 第33天游泳距離(cm)第31天 第32天 第33天假手術(shù)組 6 86.93±17.98 54.90±19.39 19.77±12.87 814.72±135.22 589.20±214.47 234.55±134.94模型組 8 113.95±17.221) 103.05±24.901) 67.23±14.551) 853.36±168.201) 830.42±256.291) 619.84±148.411)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01

2.2 免疫組化檢測結(jié)果(見表3)

表3 造模第21天、第31天后大鼠海馬CA1區(qū)tau-ps422表達(±s)

表3 造模第21天、第31天后大鼠海馬CA1區(qū)tau-ps422表達(±s)

組別 第21天后陽性目標(biāo)平均數(shù) 陽性目標(biāo)總面積 陽性目標(biāo)平均灰度值第31天后陽性目標(biāo)平均數(shù) 陽性目標(biāo)總面積 陽性目標(biāo)平均灰度值假手術(shù)組 2.61±0.12 16.19±2.03 8.40±3.11 4.01±1.05 19.87±4.12 13.85±4.16模型組 11.36±2.911) 30.61±3.252) 20.72±3.862) 20.58±4.121) 51.36±5.112) 38.62±5.282)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01,2)P＜0.05

2.3 Western blot檢測結(jié)果(見表4)

表4 造模第31天后大鼠海馬區(qū) tau-ps422表達(±s)

表4 造模第31天后大鼠海馬區(qū) tau-ps422表達(±s)

組別 tau-ps422假手術(shù)組 6.81±1.98模型組 23.96±3.281)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01

3 討 論

STZ是一種甲基亞硝基脲產(chǎn)物,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副反應(yīng)。1996年Hoyer帶領(lǐng)的研究小組首次用側(cè)腦室注射STZ的方法來干擾胰島素/受體(Ins/IR)信號系統(tǒng),使腦內(nèi)出現(xiàn)漸進性葡萄糖和糖原合成減少[4]。而有實驗證明Ins/IR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)障礙是引起AD腦內(nèi)葡萄糖/能量代謝異常的主要原因[5],在此基礎(chǔ)上形成糖基化終末產(chǎn)物(AGEs),并最終導(dǎo)致Aβ及NFT的形成[6]。2005年美國布朗醫(yī)學(xué)院的dela Monte教授和她的研究小組驗證了AD是“3型糖尿病”的假說。通過對尸檢腦組織進行檢測,發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)胰島素、IGF及其受體的蛋白含量和基因表達均較對照組明顯降低;2006年該小組通過對小鼠側(cè)腦室注射STZ的方法阻斷胰島素受體自身磷酸化和內(nèi)在的酪氨酸激酶活性[7],損傷胰島素和IGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,實驗發(fā)現(xiàn),微量的STZ未引起外周血糖升高,胰腺結(jié)構(gòu)和胰島素的免疫活性也沒受到影響;卻出現(xiàn)腦體積縮小,細胞丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、Aβ沉積增多、tau蛋白過度磷酸化、泛素化等驚人變化,學(xué)術(shù)界一致認為該模型成功地模擬了SAD的病理特征。目前認為,STZ破壞Ins/IR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低了大鼠腦內(nèi)葡萄糖利用(GU),引起腦能量代謝障礙,ATP、GTP生成減少,造成認知功能相關(guān)皮層的神經(jīng)細胞功能受損,影響突觸傳遞和突觸可塑性,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙,這也是引起基底前腦合成乙酰膽堿減少、氧化應(yīng)激、軸突和突觸損傷的基礎(chǔ)。近年進一步研究認為,大腦葡萄糖代謝低下可通過改變tau的O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)節(jié)tau的磷酸化,在AD發(fā)病機制中起著重要作用。與腦葡萄糖能量代謝障礙同時存在的葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1與GLUT3減少和tau蛋白的O-GlcNAC糖基化水平呈正相關(guān),同時也與tau蛋白的磷酸化水平呈負相關(guān)。葡萄糖代謝障礙引起Tau的O-GlcNAC糖基化修飾水平下降,促進了tau的過度磷酸化和AD重要病理改變NFT的形成[8]。

本實驗結(jié)果顯示,大鼠側(cè)腦室注射STZ后第21天即出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙,模型組與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);隨著時間的延長第31天后大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙不但沒有恢復(fù),而且有進一步加重趨勢(P＜0.01)。同時,造模第21天模型組大鼠海馬CA1區(qū)tau-ps422即有陽性表達,而假手術(shù)組則不明顯,造模第31天模型組大鼠海馬CA1區(qū) tau-ps422表達更為明顯,而假手術(shù)組幾乎沒有陽性表達。Western blot檢測結(jié)果顯示:隨著時間的延長,造模第31天模型組大鼠在50 kD～71kD之間條帶(約67kD,為tau-ps422的表達)明顯比假手術(shù)組大鼠在這一區(qū)域的條帶粗,說明造模第31天模型組大鼠海馬tau蛋白在Ser422位點的磷酸化水平明顯高于假手術(shù)組。近幾年對于tau蛋白磷酸化位點的研究表明,Ser422位點是AD特異性位點,其磷酸化使tau變成毒性分子從而拮抗正常微管相關(guān)蛋白的作用[9],Thr231,Ser396和 Ser422的進一步磷酸化則可促使tau自身聚積成纖維狀結(jié)構(gòu)。Tau羧基端(Ser396,Ser404,Ser422)的磷酸化對其形成雙股螺旋絲(PHF)起關(guān)鍵作用[10-12]。

STZ側(cè)腦室注射可引起大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬組織tau蛋白AD特異性磷酸化位點Ser422的磷酸化水平增加,這對于進一步形成PHF/NFT非常重要,因而是較為理想的散發(fā)性AD(SAD)模型,可用于AD的腦能量代謝及tau蛋白磷酸化方面的研究。

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